猪粪中3种四环素类抗生素在土壤中的动态变化及降解途径

张 健，关连珠

(1山西农业大学资源与环境学院，山西太谷030801;2沈阳农业大学农业土地与环境学院，辽宁沈阳110866)

我国自20世纪90年代初以来，饲用抗生素在畜牧业生产中得到了广泛应用［1］，以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中以预防疾病促进动物生长，在保障人类健康和促进畜牧业发展方面起了重要作用［2］。近年饲用抗生素年平均消费量已达6000 t［3］，但滥用抗生素对生态环境的不良影响表现出越来越严重的趋势，成为人们普遍关注的一个社会热点问题［4－7］。研究表明，有85%以上的抗生素经由畜禽粪尿排出体外，进入生态环境［8］。我国大多数规模化畜禽养殖场缺少环境治理和综合利用设施，畜禽粪便得不到妥善处理，抗生素会随畜禽粪便直接排入环境，造成土壤和水体的严重污染［9］。在养殖业中，四环素类抗生素(TCs)的使用范围最广且用量最大［10］，此类抗生素中最常用的是四环素(TTC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)，均是由链霉菌产生的一类具有质优价廉、广谱性特点的抗生素［11－12］。畜禽粪便常被作为农家肥用于作物栽培中，四环素类抗生素随农家肥进入土壤后的降解情况可能影响作物的生长状况，并且可以预示此类抗生素的环境风险［6］。目前相关研究主要集中在某种畜禽粪便中四环素类抗生素残留的降解情况［11，13－16］或在土壤中吸附解吸情况［17－19］，但有关随畜禽粪肥进入土壤的四环素类抗生素在土壤中降解的动态变化的研究还较少见报道，因此本试验通过室内模拟培养试验，研究随不同用量的猪粪进入土壤的TTC、OTC和CTC数量的动态变化规律，并探讨其在土壤中对各降解因子的敏感性强弱，为畜禽粪肥的合理利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自沈阳天柱山田间实验区，为黄土母质上发育的典型棕壤，其基本养分含量为:有机质含量 19.92 g/kg、全氮 0.93 g/kg、全磷 0.52 g/kg、碱解氮88.21 mg/kg、速效磷28.29 mg/kg、速效钾67.5 mg/kg，pH 6.3。

供试猪粪采自沈阳市附近一些大型集约化畜禽养殖场。猪粪的基本理化性状为:pH 6.51、有机质含量 394.4 g/kg、全氮 27.33 g/kg、C/N 比14.43、全磷 16.46 g/kg、四环素(TTC)51.05 mg/kg、土霉素(OTC)127.06 mg/kg、金霉素(CTC)115.63 mg/kg。

1.2 试验设计

1.2.1 不同用量猪粪中四环素类抗生素在土壤中的动态变化 采用室内模拟培养试验，共设置5个处理，即土壤中加入猪粪量(重量比)为1%、3%、5%、7%，分别用P1、P3、P5、P7表示，另设一个不加猪粪的对照(CK)。根据试验设计分别将猪粪与供试土壤(4Kg)混拌均匀，放入直径28cm，高20cm的塑料盆中，每个处理重复三次，完全随机排列。在室内室温(25度)下培养，定期搅拌，在培养期内保持土壤含水量在65%左右(称重法)，在培养的第0、5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180 d用小土钻在盆中采样，每次采约50g土，分别测定TTC、OTC、CTC含量。

1.2.2猪粪中四环素类抗生素在土壤中降解途径及原因分析 试验设3个处理，即灭菌避光处理、未灭菌避光处理、未灭菌光照处理。具体方法为:称取3份等量的土样(0.5kg)于三角瓶中，经过不同处理后加入等量猪粪(30g)进行培养。灭菌处理经过高温高压灭菌，避光处理于恒温培养箱22.5℃培养，光照处理于恒温光照培养箱22.5℃培养。土层厚10 cm，昼/夜光照时间为14 h/10 h。培养期为50d，在培养期内每5 d取一次样(灭菌处理采样在无菌操作台上进行，尽量保持其无菌状态)，共取10次样，测定TTC、OTC、CTC含量，每个处理重复3次。

等浓度纯品抗生素在土壤中的降解途径的试验设计方法同上。

1.3 测定方法与计算

TTC、OTC、CTC含量的测定采用高效液相色谱仪［19］。称取2 g土壤样品，加入提取液4 mL，漩涡混匀器上2500 r/min混匀1 min，25℃超声15 min，然后在4500 r/min的条件下离心15 min，重复两次，集合3次上清液过微孔滤膜。用6 mL甲醇和5mL提取液活化，通过固相萃取小柱，用甲醇洗脱固相萃取小柱，氮气吹干后，用1 mL甲醇定容，待测。TTC对照品(纯度97.5%)，CTC对照品(纯度99.9%)和OTC对照品(纯度88.2%)均购于中国药品生物检定所。高效液相色谱(LC－2010－A HT)，配2487紫外检测器，AgilentEclipseXDB－C8(4.6 ×150 mm，5μm)色谱柱，进样量为 20μL，流动相为0.01 mol/L，草酸∶乙腈∶甲醇(79∶10.5∶10.5，体积比)，流速1.0 mL/min，紫外检测波长268 nm。

光降解率=由表面光照引起的TCs含量减少率(灭菌光照处理与灭菌避光处理中各TCs降解率的差值)/减少总量(未灭菌光照处理各TCs降解率)×100%;

外源微生物降解率=由来自猪粪的外源微生物作用引起的TCs含量减少率(灭菌避光处理与未灭菌避光处理中各TCs降解率的差值)/减少总量(未灭菌光照处理各TCs降解率)×100%;

其他降解率=除微生物与表面光之外，其他原因引起的TCs含量减少率(灭菌避光处理中各TCs降解率)/减少总量(未灭菌光照处理各TCs降解率)×100%。

由于原来土壤中抗生素或微生物的存在，可能干扰了随猪粪进入土壤的这部分抗生素的变化规律，因此，文中的数据是扣除土壤中原有的抗生素的变化情况，直接分析随猪粪进入土壤的抗生素的变化情况及随猪粪进入土壤的外源微生物对抗生素的影响。

试验数据采用Excel、SPSS13.0进行计算和统计分析。

2 结果与讨论

2.1 不同猪粪用量处理土壤中四环素类抗生素的动态变化

从图1可以看出，猪粪处理土壤中3种四环素类抗生素(TTC、OTC、CTC)在培养180d内的动态变化总体趋势一致，均呈“L”型变化，但在不同培养间其减少幅度不同。从整体变化趋势来看，CTC含量在培养前期的减少幅度较大，而TTC、OTC含量则相对平缓。在180d时，猪粪中3种抗生素在土壤中的降解量大小的顺序为CTC＞OTC＞TTC。可见，猪粪中3种四环素类抗生素在土壤中的降解效果有明显的差异，主要原因是由于其分子结构和理化性质的不同，CTC反式位C5上的氢和C6位的羟基结合，可引起消除反应，而TTC降解最慢，可能是由于TTC的C5羟基与C4二甲氨基之间形成氢键，4位的差向异构难于其他抗生素。前人在研究中指出，外源抗生素在猪粪中的降解率为OTC＞TTC＞CTC［13］，添加菌剂的畜禽粪便在高温堆肥过程中的降解率为 TTC＞CTC＞OTC［15］，外源 OTC在鸡粪中的降解率大于CTC［11］，这些结果与本试验的结果有所不同。可见四环素类抗生素所处介质的性质、来源及处理方式对其降解性能有很大的影响。

图1 猪粪处理土壤中TTC、OTC和CTC的动态变化Fig．1 Dynamics of concentration of TTC，OTC and CTC of pig manures in soil

180 d时P1～P7处理中TTC、OTC、CTC含量分别为 0.18～1.56 mg/kg、0.25～2.06 mg/kg、0.09～0.87 mg/kg。猪粪低用量处理在培养前期的变化已不明显，而高用量处理则继续保持减少的趋势，但降幅已趋于平缓，且用量越高，变化越明显。5 d时，猪粪中TCs在土壤中的降解速率最大，P1～P7处理的TTC、OTC、CTC的降解速率分别为0.02～0.09 mg/(kg·d)、0.03～0.18mg/(kg·d)、0.05～0.20 mg/(kg·d)。不同培养时期各处理的含量及降解速率差异达显著水平(P＜0.05)。不同猪粪用量处理间同种抗生素含量均表现为P7＞P5＞P3＞P1，说明猪粪用量越高，其中所含的四环素类抗生素(TCs)在土壤中分解达到平稳时所需的时间越长。随猪粪进入土壤的抗生素在短期内会有较大幅度的降解，但有部分残留，且残留量随猪粪施入量的增大而增大，从而加重了对土壤环境的危害。猪粪中TCs进入土壤后，前期降解快而后期慢的原因很可能与不同浓度下抗生素被土壤吸附的形式不同有关。在高浓度时，有一大部分抗生素是以游离或物理吸附形式存在的，故容易降解;而在低浓度条件下，大部分抗生素主要以化学吸附被固定在土壤中而不易降解，并且进入中后期土壤吸附达到饱和，吸附能力下降，因此中后期时降解比较缓慢。可见在现实生产中，由于大量的畜禽粪便年复一年地施于农田，抗生素在土壤中的累积必然会日益增加，使抗生素的污染日趋严重［20－21］。

2.2 不同猪粪用量处理土壤中四环素类抗生素减少率的变化

图2显示，猪粪处理土壤中TCs的初始降解的变化速率差异不明显，5 d时各处理均在10% ～21%之间，低用量处理的减少率要略低于高用量处理，随着培养时间的延长，减少率之间的差距逐渐增大。30 d时同种抗生素的4个处理间减少率相差最大，此后差距逐渐缩小，说明低用量减少率的上升幅度小于高用量。CTCP1～CTCP7的减少率增加最快，TTCP1～TTCP7减少率的涨幅最小。40d左右时，已明显可以看出3者的减少率大小为CTC＞OTC＞TTC。60d时，低用量处理减少率基本趋于平稳，而高用量处理仍然在减少并逐步接近低用量的减少率，且在培养前期所有处理的减少率差异均达极显著水平(P＜0.01)。在培养结束时，CTC、OTC、TTC的P1处理减少率最大，分别为92.27%、80.47%、65.43%;P7减少率最小，分别为88.30%、76.90%、60.35%。猪粪中3种抗生素在土壤中降解平均半衰期为TTC ＞OTC＞CTC，分别为17.43 d、31.32 d、49.48 d，可见猪粪所含3种TCs在土壤中的半衰期相差较大。所有处理土壤中四环素类抗生素(TCs)的减少率均与猪粪用量呈负相关，与培养时间呈正相关，且用量越大，相同时间之间的相关性越强，但差异不显著(P＜0.05)。可见猪粪中抗生素在土壤中的半衰期与其种类和施入量有关。

图2 不同猪粪用量处理土壤中四环素类抗生素的减少率Fig．2 Dynamics of transformation percentage(%)of TCs of pig manures in soil

2.3 三种四环素类抗生素在土壤中降解途径的研究

图3 50 d时不同条件下TCs在土壤中的降解状况Fig．3 Degradation of TCs in soil under different treatments at 50d

由于本试验主要研究猪粪施入土壤后对抗生素降解的影响，因此本试验的所得数据均为猪粪处理减去纯品对照的差值，排除了土壤本身的影响，能更好地反映各处理猪粪中抗生素的变化情况。抗生素在土壤中会发生吸附和降解，本试验着重研究其降解行为，抗生素在土壤中的降解主要有微生物降解、光降解和化学降解三种途径。3种抗生素在不同猪粪处理的降解率均高于纯品对照(图3)，3种四环素类抗生素进入土壤后不能被完全降解。50d时，未灭菌光照处理即自然状态下三种TCs的降解顺序为CTC ＞OTC＞TTC，分别为96.67%、92.67%、86.67%。灭菌和避光处理不同程度地减缓了3种TCs在土壤中的降解。土壤经过灭菌处理后，微生物已经被消除，试验中微生物降解的部分主要依靠来源于猪粪中的外源微生物。从图4可以看出，在培养50d内，外源微生物降解率与其他降解率均呈上升趋势，而光降解率有所下降，但不同种类TCs的变化幅度有所差异。CTC、TTC、OTC的外源微生物降解率比对照分别提高了11.12%、17.66%、20.74%;光降解率分别降低了14.54%、21.97%、25.06%;其他降解率提高了4.08%、4.09%、4.25%，这可能由于随着培养时间的延长，来自猪粪的外源微生物逐渐活跃起来，对抗生素的降解也有所提高，而光照只能作用于土壤表面，作用效果有限，短期内效果明显，其中CTC的变化最明显。3种四环素类抗生素中，外源微生物对TTC的降解作用最大，光照对CTC的降解作用最强，而其他降解对3种TCs的作用相当，这与抗生素的理化性质有关［22－24］。可见，不同降解作用对同种TCs的影响不同，同种降解作用对不同TCs的影响也不同。四环素类抗生素属于氢化并四苯环衍生物，TCs母核由A、B、C、D 4个环组成，主要官能团包括C2位的酰胺基、C4位的二甲氨基、C10位的酚羟基等，避光可以减缓这些官能团的破坏。研究也证明，TCs中C环C6的羟基和不稳定的A环手性原子C4易发生差向异构和降解反应［25］，所以光照在一定程度上促进TCs的降解。以往研究也指出四环素类抗生素对光照敏感，有光解特性［22，16］。抗生素在环境中的降解与其化学特性、环境条件和使用剂量有关［2］。

图4 不同处理条件TTC、OTC和CTC的降解率占降解总量的百分比Fig．4 Percentage of TTC，OTC and CTC by different degradation accounted for total

在培养50d时，外源微生物的降解率占降解总量的75%以上;光降解率占8%～17%;而其他作用的降解率所占比例在7%左右。说明引起猪粪中TCs进入土壤后降解率提高的主要是外源微生物的降解。因此减少土壤中抗生素含量的有效手段是增加微生物数量，外源添加有益降解菌剂有助于抗生素药物残留的去除。

3 结论

1)猪粪中3种四环素类抗生素进入土壤后含量在短期内迅速下降，且降解速率差异显著(P＜0.05)，中后期变化逐渐趋于平稳，但降解速率和变化幅度因抗生素种类而异。在培养180 d时，猪粪中含有的3种四环素类抗生素中金霉素(CTC)在土壤中的降解效果最好，四环素(TTC)的降解效果最不明显。

2)在一定范围内，猪粪中所含的TTC、OTC、CTC在土壤中的减少率和变化速率与猪粪的施入量呈一定的负相关，与培养时间呈正相关。低用量处理的降解效果明显好于高用量处理。

3)猪粪中四环素类抗生素在土壤中的降解效果要好于纯品抗生素，降解量的提高主要依靠外源微生物降解，在土壤中的外源微生物降解率为CTC＞OTC＞TTC，且随着时间的延长，外源微生物的降解作用逐渐增强。

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