新疆石河子垦区副猪嗜血杆菌的流行病学调查

张 岩 李 劼 张银国*

（新疆石河子大学动物科技学院，新疆石河子市 832003）

新疆石河子垦区副猪嗜血杆菌的流行病学调查

张 岩 李 劼 张银国*

（新疆石河子大学动物科技学院，新疆石河子市 832003）

通过对石河子垦区规模化猪场的副猪嗜血杆菌 （Haemophi l us parasuis，Hps）进行流行病学调查，了解了当地规模化猪场副猪嗜血杆菌的流行现状。调查结果显示，330份血清样品的Hps抗体阳性率为60.30%，猪场感染阳性率为91.67%；经PCR检测，105份病料的阳性率为27.62%。

副猪嗜血杆菌；流行病学；调查

副猪嗜血杆菌 （Haemophilus parasuis，Hps）可引起猪全身纤维素性多发性浆膜炎和关节炎，主要存在于猪的上呼吸道，是呼吸道综合症的主要继发细菌性病原[1]。Hps还可引起败血症，并且可能在急性感染后留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行[2]。近年来，副猪嗜血杆菌病的发病率越来越高，并且Hps强毒在早期断奶和采用 “三点式”养殖的猪体内定居和传播，可改变副猪嗜血杆菌的流行病学特征[3]。所以，要防制猪群感染Hps，首先要了解Hps的流行情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

从垦区内的12个规模猪场随机无菌采集血清，共330头份；采集具有明显呼吸道病症状的病猪肺脏组织、胸腔积液、心包液等病料105头份。

1.1.2 主要试剂及仪器

副猪嗜血杆菌间接血凝诊断试剂盒，兰州兽医研究所；副猪嗜血杆菌灭活疫苗，中牧实业股份有限公司；PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统，Bio-Rad公司。

含5%血清的胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA），胰蛋白大豆肉汤 （Tryptic Soy Broth，TSB），普通琼脂巧克力平板等，实验室自制。

TE 溶液、 10×Buffer、 25 mmol/L MgCl2、 2.5mmol/L dNTPs、 2.5U Taq 酶，北京诺维森生物科技有限公司；DL2000 Marker，广东东盛生物科技有限公司。

1.1.3 引物合成

根据副猪嗜血杆菌16S rRNA（M75065）序列设计引物[4]，由上海生工生物工程有限公司合成，预期扩增的目的片段为822 bp。

Hps-16S rRNA上游引物：5’-GG CTTCGTCACCCTCTGT-3’

Hps-16S rRNA下游引物：5’-GT GATGAGGAAGGGTGGTGT-3’

1.2 方法

1.2.1 现场情况调查

向猪场的工作人员了解发病猪的年龄、临床症状、发病率、死亡率以及用药与治疗效果等情况；剖检可疑病猪，观察病猪的肺、胸腔、心包膜、关节等组织器官的病理变化。

1.2.2 血清抗体检测

经前腔静脉无菌采集猪血 （未注射过疫苗），待血液静置凝固后，于离心机中4 000转/分离心10分钟，收集血清，-20℃保存备用。用副猪嗜血杆菌间接血凝诊断试剂盒进行抗体检测。

1.2.3 PCR鉴定

1.2.3.1 病原分离培养

取病猪肺脏、肺淋巴结、胸腔积液与心包液，接种于含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD）和5%血清的TSA培养基与巧克力平板中，置于烛缸中，37℃培养24～48小时，挑取灰白色透明可疑菌落接种于含有NAD和血清的TSB培养基中纯化培养。将纯化的细菌革兰氏染色，选取两极浓染短小杆菌进行接触酶试验与硝酸盐还原试验，呈阳性者初步确定为副猪嗜血杆菌。

1.2.3.2 PCR模板制备

吸取可疑菌液1 mL，灭活疫苗0.5mL（阳性对照），分别置于1.5 mL离心管中，12 000转/分离心10分钟，弃上清；沉淀用1mL TE溶液洗涤1～2次，弃上清；用40μL无菌去离子水将沉淀重悬，置于沸水浴中10分钟；最后10 000转/分离心10分钟，收集上清即为模板。

1.2.3.3 反应体系与反应条件

反应体系（25 μL）：10×Buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、 2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL，10μmol/L上、下游引物各 1μL，模板 5μL，2.5 U Taq酶0.2μL，灭菌去离子水11.8μL。

反应条件：预变性94℃4分钟，变性94℃ 50秒，退火54℃ 50秒，延伸72℃1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。取扩增产物10μL在1.5%琼脂糖凝胶中，以电压100 V电泳40分钟，凝胶成像观察结果。

2 结果与分析

2.1 临床观察结果

临床症状主要表现为发热、消瘦、呼吸困难、关节肿胀、跛行等 （图1）。剖检可见胸膜炎症状明显 （包括心包炎和肺炎），关节炎次之，以浆液性、纤维素性渗出为炎症特征。肺有间质水肿、粘连，心包积液、粗糙、增厚，腹腔积液 （图2）。使用青霉素、土霉素、头孢菌素类以及庆大霉素等药物治疗可减轻临床症状，但停药后很快复发。

2.2 血清流行病学调查结果

石河子垦区规模猪场中副猪嗜血杆菌病多发于冬、春季，主要感染断奶后和保育阶段的猪 （40～70日龄），发病率在10%～35%，死亡率可达40%。

330 份血清样品中Hps抗体阳性率为 60.30% （199/330），12个猪场中仅有1个猪场未检测到Hps抗体，猪场阳性率达 91.67% （11/12）。

2.3 PCR鉴定结果

2.3.1 病原分离培养结果

注：1.“绒毛心”；2.胸膜粘连；3.被覆薄层纤维蛋白膜的肝脏

在TSA培养基和巧克力平板上均见针尖大小、灰白色透明、光滑湿润、边缘整齐的菌落，染色镜检确定为两极浓染的G-小杆菌。

2.3.2 PCR结果

经PCR鉴定，105份病料中，阳性样品为29份，检出率27.62% （29/105），部分病料PCR结果见图3。

3 讨论

副猪嗜血杆菌病主要感染2周龄至4月龄的青年猪，尤其是哺乳仔猪、断奶后10天左右的猪更易发生[5]。此次用于流行病学调查的病死猪均为断奶后的保育猪，即断奶后10天左右的猪，所以更易发病，且死亡率较高。未见母猪和育肥猪发病死亡，其原因尚须进一步研究。

血清学调查结果和PCR鉴定结果表明，副猪嗜血杆菌在垦区的抗体检测阳性率为60.30%，而PCR鉴定阳性率为27.62%，低于抗体检测阳性率，这可能是由于使用了抗生素，以及副猪嗜血杆菌分离困难等原因所致。加拿大安大略省某实验室经回归分析法分析显示，由于部分采集来的样品不能确定是否存在副猪嗜血杆菌[6]，导致该病的实际发病率可能为报道的10倍之多。

对石河子垦区规模化猪场的副猪嗜血杆菌病流行病学调查结果表明，石河子垦区部分规模化猪场已存在本病，并已造成一定的经济损失。为防止该病的暴发流行，应采取及时综合预防措施，加强饲养管理，保持环境卫生。

[1]林雪玲，黄耿森，冼琼珍，等.副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用.吉林农业大学学报，2006，28 （3）：321-324.

[2]马延庆.副猪嗜血杆菌病的危害与防制.养殖技术顾问，2010，（1）：122-123.

[3]薛国聪，任涛.副猪嗜血杆菌病流行病学及致病因子的研究进展.中国畜牧兽医，2009，36（5）：168-171.

[4]Oliveira S，Galina L，Pijoan C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections.J Vet Diagn Invest,2001,13（6）:495-501.

[5]甘孟侯，杨汉春.中国猪病学.北京：中国农业出版社，2005：327-330.

[6]斯劳特，阿莱尔，蒙加林，等.赵德明，张中秋，沈建忠，等译.猪病学（第9版）.北京：中国农业科技出版社，2008：769-776.

S852.61

A

1673-4645（2013）03-0050-02

2013-01-09

张岩 （1987-），男，硕士研究生

张银国 （1956-），男，教授