猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上最佳增殖条件的研究

张明波 李立莉 卢爱国 袁明霞 张明艳 徐世文

（1东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨 150030；2哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨 150069）

猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上最佳增殖条件的研究

张明波1，2李立莉2卢爱国2袁明霞2张明艳2徐世文1＊

（1东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨 150030；2哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨 150069）

为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）HuN4-F112株，优化了细胞培养条件、病毒接种剂量、收毒时间和病毒液冻融次数等条件。结果证明Marc-145细胞在MEM培养基、新生牛血清含量8%、细胞接毒密度1.5×105个/mL、pH 7.1条件下生长状态最好；PRRSV HuN4-F112株的最佳接种剂量为3.0×105TCID50/mL，收毒时间为接种后70～72小时，在-18℃冻融3次，PRRSV HuN4-F112株增殖效果最好。该结果为HuN4-F112株PRRSV疫苗的生产提供了依据。

PRRSV；HuN4-F112株；Marc-145细胞；增殖条件

猪繁殖与呼吸综合征（porcinere productive and respiratory syndrom，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） 引起的，1992年国际兽医局（OIE）将其正式命名，该病主要临床特征是引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难。OIE将该病列为必须报告的动物疫病[1]。该病在世界范围内已流行近30年，仅在美国每年因P R R S给养猪业造成的经济损失就达5.6亿～7.6亿美元[2,3]。我国于1996年确认存在猪繁殖与呼吸综合征。2006年，我国出现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，给养猪业造成巨大的经济损失[4,5]。目前，该病已成为我国养猪业的第一大疫病。

为预防和控制该病，农业部组织有关单位先后进行了PRRSV灭活疫苗（N V D C-J X A 1株） 和冻干活疫苗（HuN4-F 112株）的研究和试生产。目前，预防此病的主要产品是冻干活疫苗（HuN4-F 112株）[6]，培养 PRRSV常用的细胞为Marc-145细胞系。本研究旨在探索PRRSVHuN4-F 112株在Marc-145细胞上的最佳增殖条件，为PRRSVHuN4-F 112株活疫苗的生产提供培养条件依据，为在合适的生产成本条件下进行规模化疫苗生产提供研究基础。

1 材料及方法

1.1 毒株及主要材料

毒株HuN4-F 112株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，Marc-145细胞购自美国ATCC公司，ME M培养基为美国Gibco公司产品，新生犊牛血清为山东劲牛生物科技有限公司产品，胰酶为美国Gibco公司产品，48孔细胞培养板和细胞培养瓶为Thermo Fisher公司产品。

1.2 仪器设备

倒置显微镜为奥林帕斯显微镜，无菌操作间和恒温培养间为新通过G MP验收的生产车间万级（局部百级）无菌室及培养室，C O2培养箱为日本三洋公司产品，转瓶培养机为蓝州飞控器械总厂产品。

2 方法

2.1 血清质量检测及灭活

每一批血清在使用之前先要进行无菌、支原体和牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的检验，检测结果均为阴性才能用于Marc-145细胞培养，每瓶血清使用前于65℃水浴灭活30分钟。

2.2 细胞的复苏及传代培养

自液氮罐中取出安瓶冻结的生产用细胞，立即置于37℃恒温水浴槽中，轻摇使细胞融化，1500转/分钟离心5分钟，倒去上清加入细胞生长液吹打，无菌吸出细胞悬液加入到T 75细胞培养瓶中，加入细胞生长液，37.5℃培养至形成单层细胞。

弃去培养瓶中的培养液，加入0.25%胰酶2～4mL对细胞进行消化，至细胞接近雾化时迅速弃去胰酶，加入30mL培养液，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，将悬液分成3瓶，置37.5℃下继续培养，观察细胞贴壁生长情况。待细胞长至单层继续传代或用于试验[7]。

2.3 病毒的复壮

取长成单层的Marc-145细胞，弃去营养液，加入稀释好的病毒液，补加维持液，置于37.5℃下培养；每天观察细胞病变（C P E），当C P E达到80%时，冻融2次，于-20℃保存。

2.448 孔细胞培养板培养细胞

培养瓶中长成单层的细胞传代时，按106个/mL细胞浓度以每孔400μL细胞悬液加入到48孔细胞培养板中，然后轻轻振荡细胞培养板，使细胞分散均匀，置于体积分数为5%的C O2培养箱中于37.5℃培养。

2.5 病毒含量（TCID50） 的测定

将待测定病毒按10倍系列稀释至10-7，取 10-5、10-6、10-7三个稀释度各100μL，加入长成单层的48孔Marc-145细胞培养板，同时设未接毒细胞阴性对照和稀释浓度为10-1的病毒阳性对照。参照R e e d-Mu e n c h法[5]，测定和计算TCID50。

2.6 细胞生长液最佳血清含量测定

分别使用血清含量为2%、5%、8%、10%四个浓度的ME M培养基培养Marc-145细胞，48小时后弃去营养液，接种病毒液1mL于T 75瓶。加入含3%血清含量的ME M培养基，逐日观察C P E，当C P E达70%～80%时收获病毒液，于-18℃反复冻融3次，分别测定病毒TCID50，以其中TCID50最高者为细胞生长液最佳血清含量。

2.7 MEM培养基最佳pH测定

将含8%犊牛血清的ME M培养基p H值 调 整 为 6.6、 6.9、 7.0、 7.1、7.2、7.3、7.4、7.6、7.8，分别作为生长液用于培养Marc-145细胞，接毒、收获和判定标准同前，分别测定病毒TCID50，以其中TCID50最高者为最佳p H[1]。

2.8 最佳细胞接种密度试验

将消化、分散后的细胞浓度分别调整为约 5.0×104、1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105个 /mL六个浓度，分别取等量（10mL） 置于T 75细胞培养瓶中培养，待细胞长成单层时分别接毒，接毒剂量、收毒和判定标准同前，以确定适合细胞生长与病毒增殖的最佳细胞密度。

2.9 最佳接毒剂量试验

分别以 1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、4.0×105TCID50/mL五个剂量接种病毒于已长成单层细胞的T 75细胞培养瓶，收毒和判定标准同前，分别测定病毒TCID50，以其中TCID50最高者为最佳接毒剂量。

2.10 病毒冻融次数试验

收毒后，分别在-18℃条件下冻融1、2、3、4、5、6次，测定病毒TCID50，以其中TCID50最高者为病毒冻融次数的标准。

3 结果

3.1 病毒复壮后病毒滴度

病毒复壮后，其滴度为107.17TCID50/mL。

3.2 细胞生长液最佳血清含量

从表1可以看出，取8%作为ME M培养基中犊牛血清的最佳含量。

3.3 MEM培养基最佳pH值

当p H值为7.0～7.1时，细胞生长状态正常，接毒后产毒滴度为107.17TCID50/mL。考虑病毒复制后p H值易减小的因素，所以取p H7.1为病毒复制最佳p H值（表2）。

3.4 最佳细胞接毒密度

从表3可见，病毒滴度与细胞接种量无线性关系。细胞密度在1.5×105个 /mL时，其 TCID50最高（107.37TCID50/mL），因此取细胞密度在1.5×105个/mL为最佳细胞接毒密度。

表1 细胞生长液最佳血清含量的测定

3.5 最佳接毒剂量试验

从表4可以看出，接毒量为3.0×105TCID50/mL时，细胞所产病毒液TCID50较高（107.33TCID50/mL），因此，在生产实践中取3.0×105TCID50/mL为最佳接毒剂量。

表2 MEM培养基最佳pH值的测定

表3 最佳细胞接毒密度的测定

表4 最佳接毒剂量的测定

表5 最佳冻融次数的测定

表6 最佳收毒时间的测定

3.6 最佳冻融次数试验

当冻融次数为3次时，病毒TCID50最高（107.17TCID50/mL）。因此取冻融3次作为最佳冻融次数（表5）。

3.7 最佳收毒时间试验

在70～72小时，镜下观察C P E基本达到80%～85%，经检测此时病毒TCID50为107.17/mL，达到最高值，因此取病毒感染细胞后70～72小时作为最佳收毒时间（表6）。

4 转瓶培养

按以上所有最佳条件在10L转瓶中用1L液体继续培养，获取最佳病毒滴度为107.5TCID50，说明转瓶培养相比较静止培养，能够更好地促进病毒充分获取营养及提高病毒在细胞机体内的复制机能。

5 讨论

Marc-145细胞作为PRRSV HuN4-F 112株复制的载体，其生长形态、健康状况、培养液的各项理化指标对病毒的增殖有较大影响，甚至连收毒时间、冻融次数等也可以成为影响病毒滴度的关键因素。但值得注意的是，当用于接种的病毒效价越高，需接种的病毒量、接毒时间、细胞密度等因素都会随之改变，所以稳定的种毒也是疫苗规模化生产中的关键因素。

[1]朱文革,贺云霞,周振成,等.PRRSV N V D C-J X A 1株在Marc-145细胞上增殖条件的优化.动物医学进展,2010,31(6):66-69.

[2]张建新,王旭田,司献军.高致病性猪蓝耳病及其防控.中国动物保健，2007(7):17-19.

[3]邓富江.大力发展生猪养殖 满足人民肉食需求.肉类工业,2008,324(4):1-2.

[4]张银田.我国高致病性猪蓝耳病疫情及防控情况.兽医导刊,2007,119(7):12-14.

[5]蓝海楠,张辉,崔焕忠,等.Marc-145细胞培养条件摸索及其初步应用.中国畜牧兽医,2011,38(5):220-223.

[6]汤景元,姜平,蒋文明,等.表达PRRSVM蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性的研究.中国病毒学,2005,20(6):618-622.

[7]R.I.弗雷谢尼（英）.动物细胞培养基本技术指南 (第五版).章静波,徐存拴等译.北京：科学出版社,2012.

S858.28

B

1673-4645（2013）07-0038-03

2013-05-29

张明波，男，黑龙江人，硕士生，研究方向：动物医学

徐世文，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：临床兽医学