猪繁殖与呼吸综合征高免血清的制备与临床治疗试验

李 阳 徐宗香 陈 曦 张鹏宇 潘 文

（1黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006；2黑龙江省齐齐哈尔动物医院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

猪繁殖与呼吸综合征高免血清的制备与临床治疗试验

李 阳1徐宗香1陈 曦1张鹏宇2潘 文2

（1黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006；2黑龙江省齐齐哈尔动物医院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

为筛选免疫效价高的疫苗，获得高免血清并进行临床治疗观察。本试验选用3种猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫健康新西兰大白兔，免疫后分别采血和分离血清，并用猪蓝耳病毒抗体PPA-ELISA检测试剂盒检测血清抗体效价，筛选出抗体效价较高的两种疫苗；免疫猪，制得高免血清对自然发病仔猪进行高免血清治疗试验。免疫兔试验表明，猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（CH-lR株）免疫后血清抗体效价最低，高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）血清（简称高致病疫苗血清）抗体效价比猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（CH-la株）血清（简称灭活疫苗血清）低，用后两种疫苗免疫猪，血清抗体效价均能达到1∶1280。自然发病仔猪高免血清治疗试验显示，注射高致病疫苗血清对蓝耳病的治愈率为88%，灭活疫苗血清治愈率为76%。结果表明高免血清是无菌、安全的，所得两种血清可用于临床防治猪蓝耳病。

猪繁殖与呼吸综合征；疫苗；血清抗体效价；高免血清

猪繁殖与呼吸综合征（P R R S），又称猪蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） 引起的一种接触性传染病，各日龄猪只均可发病，1987年由美国首先报道[1]。该病以妊娠母猪流产、死产、产木乃伊胎和仔猪呼吸道症状为主要特征，传染性强，危害性大，还可继发感染其他疾病，给养猪业带来巨大的经济损失。由于病毒本身特性和机制，使其可逃避免疫系统的攻击，延缓机体保护性抗体的产生，致使疫苗和药物往往无法达到应有的效果。

高免血清作为一种特异性抗体，能与体内病毒发生特异性中和作用，从而抑制该病毒，临床治疗与疫苗联合应用可有效防治猪蓝耳病，本研究筛选抗体效价较高的疫苗，制备猪蓝耳病高免血清，并开展临床治疗试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 商品疫苗

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F 112株，20头份/瓶，批号：2012006）；猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（C H-l a株，25头份/瓶，批号：2011013）；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（C H-l R株，50mL/瓶，批号：2012002）。以上疫苗均由哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.1.2 试验动物

5只健康幼龄豚鼠；10只健康新西兰大白兔（体重2.5k g左右），均由黑龙江省齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。选取猪繁殖与呼吸综合征洁净猪场28～32日龄的健康长白仔猪，进行E L I S A检测，确定猪繁殖与呼吸综合征抗体为阴性，任选4头。齐齐哈尔市附近地区4个猪场已确诊为自然发病的幼龄仔猪50头。

1.1.3 试验仪器和试剂

冷冻离心机（天津泰斯特仪器厂）；酶标仪R a y t oR T-6000，全自动洗板机R a y t oR T-3100（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。猪蓝耳病毒抗体P P A-E L I S A检测试剂盒（山东省绿都生物科技有限公司）；猪繁殖与呼吸综合征病毒E L I S A抗体检测试剂盒（武汉科前动物生物制品有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 试验兔子免疫程序

将10只兔子分成3组（A组、B组、C组），每组3只兔子，另设一个阴性对照。首次免疫前采集空白兔血作为阴性对照。首次免疫：A组兔子，分别在背部皮下和腿部肌肉多点注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗2mL/只（疫苗说明书建议每头仔猪接种1mL）；B组兔子，分别在颈部皮下和腿部肌肉多点注射猪繁殖与呼吸综合征活疫苗2mL/只（疫苗说明书建议每头仔猪接种1mL）；C组兔子，分别在颈部皮下和腿部肌肉多点注射猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗2mL/只（疫苗说明书建议每头仔猪接种1mL）。首次免疫后两周以相同方式进行二次免疫，每只兔子注射4mL。二次免疫后两周以相同方式进行三次免疫，每只兔子注射8mL。相隔两周后进行第四次免疫，每只兔子注射12mL。每次免疫，按相同方法给对照试验兔子注射与免疫剂量相同的生理盐水。

1.2.2 试验猪免疫程序

在首次免疫前采集空白猪血样作阴性对照。根据兔免疫试验结果，将试验猪分成两组（一组、二组）。首次免疫，一组猪于颈部肌肉注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗2mL/头；二组猪颈部肌肉注射猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗2mL/头。首次免疫后两周以相同方式进行二次免疫，每头猪注射4mL。间隔两周后以相同方式进行三次免疫，每头猪注射8mL。间隔两周后进行第四次免疫，每头猪注射12mL。

表1 兔血清抗体效价检测

表2 注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的猪抗体效价

1.2.3 高免血清的制备和安全性试验

每次免疫试验前试验猪少量采血检测其抗体效价。当检测猪血清抗体效价达到要求时，对猪进行前腔静脉采血，采得的血液均用自然凝结法分离血清，加入双抗（每毫升各加1000U的青霉素、链霉素）和0.01%的硫柳汞，部分少量分装。随机抽取自制的血清样品，分别接种于普通琼脂平板、S.S琼脂和血平板中，37℃培养48小时。同时将自制血清样品，分别给5只健康幼龄豚鼠进行皮下注射1mL，观察豚鼠反应。

1.2.4 高免血清E L I S A效价的检测

（1） 兔血清抗体检测

试验兔最后一次免疫2周，用兔心脏采血法（之前均用耳缘静脉采血法）自然凝结分离血清。兔血清效价检测用猪蓝耳病毒抗体P P A-E L I S A检测试剂盒，该试剂盒是专门针对兔血清的检测试剂盒。参照试剂盒说明书，阴性对照孔 O D450≤0.2，阳性对照孔 O D450≥0.4，试验成立；临界值=0.18+阴性对照均值，样品O D450值≥临界值判定为阳性，样品O D450＜临界值为阴性。结果见表1。

（2） 猪血清抗体检测

试验猪最后一次免疫2周，对猪进行前腔静脉采血，自然凝结分离血清，将血清从1∶40倍比稀释至1∶5120。参照试剂盒说明书，阳性对照孔O D630≥0.7，阴性对照孔 O D630＜0.3，试验成立；K Q值=样品O D630值×100／阳性对照O D630平均值，K Q≥20的样品为阳性，K Q＜20的为阴性。结果见表2和表3。

1.2.5 临床治疗试验

在齐齐哈尔市周边地区的4个猪场，选择自然发病的仔猪50头，平均分两组，分别注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫制备的猪血清和猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫制备的猪血清。根据体重每头猪注射3～5mL高免血清，24小时未痊愈的，相同剂量再注射一次。

2 结果

2.1 疫苗免疫效价

试验对兔子分别用3种疫苗免疫，由表1可知，相同免疫次数和剂量的条件下，C组猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗抗体效价最高，其次是A组高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，B组试验中注射猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的兔血清抗体效价上升最慢，对照组血清效价没有变化。这里选用效价较高的两种疫苗对猪进行免疫。

分别对试验猪注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗两种疫苗，最后一次免疫后，血清E L I S A抗体检测结果（表2和表3），按照试剂盒说明方法换算，血清倍比稀释到1∶1280时两种疫苗血清均为阳性，在相同稀释条件下猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗血清效价要稍高些。

表3 注射猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的猪抗体效价

2.2 血清无菌性试验和安全性试验结果

高免血清细菌培养均无细菌生长。血清注射豚鼠后观察3天，豚鼠均健康，无异常表现。

2.3 治疗效果观察

发病仔猪表现呼吸困难、厌食、发热、眼睑水肿、打喷嚏、耳紫和躯体末端皮肤发绀等症状，从开始治疗后3天，以上症状明显减退或消失，没有死亡现象，判为治愈，否则判为无效。给25头发病仔猪注射高致病疫苗血清，22头猪临床症状消失，治愈率为88%。注射灭活疫苗血清的25头猪中，1头猪死亡，临床表现上19头猪恢复正常，治愈率为76%。

3 讨论与分析

由于病毒发生变异，细菌毒力增强，且逐渐呈现非典型性，给猪病的诊断和治疗带来很大难度。猪繁殖与呼吸综合征属于免疫抑制性疾病，极易与猪瘟和猪圆环病毒发生混合感染，还容易继发多种细菌性疾病，使得疫苗和药物治疗往往不能达到理想的效果。对于规模化养猪场在疫病紧急控制方面，使用高免血清是比较有效的措施之一。目前市售的猪蓝耳病商品化血清极少，质量参差不齐。

由于目前还没有关于猪繁殖与呼吸综合征血清制备的标准，因此本试验是在有关文献报道的基础上开展的[2-4]。本试验旨在制备由高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫的血清，选用黑龙江地区经常使用的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（C H-l R株） 和猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（C H-l a株）作为对比试验，但在免疫兔试验中发现猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（C H-l R株） 抗体效价最低，且猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗血清效价高于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗血清，因此在制备高免血清的试验中用效价较高的两种疫苗免疫试验猪，结果，灭活疫苗血清效价仍然较高，但对两种高免血清治疗效果的观察来看，高致病疫苗血清治愈率要稍高一些。分析原因如下：首先，可能由于疫苗佐剂的不同，本试验中油佐剂灭活疫苗产生抗体效价更高；其次，两种疫苗所用毒株不同，一个是高致病型，一个是经典型，临床试验结果表明目前蓝耳病流行以高致病性蓝耳病居多。产生以上现象的原因还需要进一步试验论证。

本实验的临床治愈率并没有报道的那样高，一方面是由于个别猪的病程较长，即便使用血清治疗，效果还是不佳，因此本病应该及早发现及早治疗；另一方面，病猪并非单纯感染猪繁殖与呼吸综合征病毒，而是同时感染了其他病菌，影响了多价、高效血清的治愈效果。另外，同时或在较短时间间隔内注射两种或两种以上疫苗，往往会影响血清抗体水平，例如，猪瘟、猪蓝耳病和猪口蹄疫疫苗的免疫[5,6]，因此，制定合理的免疫程序是制备高免血清的一个关键。本研究中制备的高免血清对于临床治疗是有效果的，对仔猪也没有产生不良反应。因此，制备高效价、多联的高免血清是我们下一步要研究的重要内容。

[1] Wensvoort G, TerpstraC, Pol JMA,et al. Mystery swine disease in the Netherlands:the isolation of Lelystad virus. Vet Q,1991, 13: 121-130.

[2]郭一,陈洁,金尔光,等.猪瘟—猪蓝耳病—猪圆环2型三联高免血清的制备.湖北畜牧兽医,2011(11):6-7.

[3]韩庆彦,祁广义,李腾龙.H C-P R R S-A P P高免血清对圆环病毒Ⅱ型感染的控制效果.中国兽医杂志,2005(7):50-51.

[4]邓大旺,陈丽萍,崔健扬.浅析兔抗猪高致病性蓝耳病高免血清的制备和鉴定.中国畜牧兽医文摘,2012(5):43-44.

[5]张长龙，严宝英，贾文孝,等.猪瘟、猪口蹄疫、高致病性猪蓝耳病疫苗免疫试验初探.动物医学进展,2009(7):101-103.

[6]李敏玲,王军玲,郑红霞.猪瘟疫苗（兔源）、猪O型口蹄疫疫苗、猪蓝耳病疫苗不同组合免疫的效果.畜禽业,2009(1):55-56.

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2013-05-15