基于实验室常规指标建立肝纤维化Fisher判别模型

谢康生，郑兰兰，贾春红，苏建平

1.平煤集团十矿医院内科，河南 平顶山 467021;2.平煤医疗集团总医院

明确肝病患者的肝纤维化程度对治疗选择、预后判断及疗效评估具有重要的临床意义，肝穿刺活检是目前公认的诊断肝纤维化程度的金标准，但有创性操作患者依从性较差、取样误差、病理观察者之间的误差决定了其难以成为临床常规检查手段，寻找有效的非创伤性诊断手段来替代肝活检评估肝纤维化程度是肝病学者致力研究的重要课题。目前报告的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的非创伤性肝纤维化预测模型主要有 APAG 指数［1］、S 指数［2］、Hui模型［3］、曾氏模型［4］，但这些模型仅是二分类模型，其价值在于区分部分患者有无显著性肝纤维化或肝硬化的存在，而不能较准确地预测患者的肝纤维化分期属于哪个具体级别［5］，其有效性也未得到明确验证。本研究应用行肝活检的174例CHB患者的常规实验室指标进行量化建模，旨在为肝纤维化分期提供安全可靠的非侵入性评估工具。

1 资料与方法

1.1 一般资料 考核样本来自2009年1月－2012年12月平煤集团十矿医院、平煤医疗集团总医院行肝活检的CHB患者174例，CHB诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》［6］标准。男102例，女72例;年龄32～74岁，平均年龄(46.28±9.36)岁;排除酒精性肝损害、丙肝、抗病毒治疗病例。

1.2 循证指标 根据相关文献，初步拟定以下指标作为建模变量:Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、层黏连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酞转肽酶(γ-GT)、总胆红素(TB)、血小板(PLT)、血清白蛋白(ABL)、球蛋白(G)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血脂谱(TC、TG、HDL、LDL)、碱性磷酸酶(ALP)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、凝血酶原时间(PT)。检测于肝穿活检前2周内进行，空腹取静脉血分离血清，低温保存待测，由固定专业人员进行操作。

1.3 经皮肝组织活检 在彩色多谱勒超声引导下定位，确定穿刺深度，采集肝组织1.5～2.0 cm，石蜡包埋，连续切片，HE染色，由同一对实验室检测结果不知情的病理诊断师阅片，并参照文献［7］的分期标准作出诊断:S0:无纤维化，S1:包括汇管区、汇管区周围纤维化和限局窦周纤维化或小叶内纤维瘢痕，二者均不影响小叶结构的完整性，S2:纤维间隔即桥接纤维化，主要由桥接坏死发展而来，S2虽有纤维间隔形成，但小叶结构大部分仍保留，S3:大量纤维间隔，分隔并破坏肝小叶，致小叶结构紊乱，但尚无肝硬化，S4:早期肝硬化，肝实质广泛破坏，弥漫性纤维增生，被分隔的肝细胞团呈不同程度的再生及假小叶形成。

1.4 统计学方法 首先进行肝纤维化组织学分期与常规指标的Spearman等级相关法分析，有统计意义后的指标再行Fisher判别分析，建立判别函数，绘制投影图，回代法考察函数的诊断性能，Kappa系数法一致性检验，统计软件为SPSS 16.0。

2 结果

2.1 肝纤维化组织学分期与血清肝纤维化指标的关系 随着肝纤维化组织学分期由S0→S4的升高，血清学指标PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN、HA也逐渐升高，即正相关关系，相关系数(r)由大到小依次是HA(0.569)＞LN(0.428)＞ PC-Ⅲ(0.405)＞C-Ⅳ(0.395)(见表1)。

表1 肝纤维化分期与血清肝纤维化指标的关系(，μg/L)Tab 1 The correlation of the liver fibrosis stages and the serum liver fibrosis markers(，μg/L)

表1 肝纤维化分期与血清肝纤维化指标的关系(，μg/L)Tab 1 The correlation of the liver fibrosis stages and the serum liver fibrosis markers(，μg/L)

2.2 肝纤维化分期与其他参数的相关性 肝纤维化分期与 ALT、AST、γ-GT、TB 正相关，r分别是 0.445、0.412、0.317 和 0.396，与 PLT、ALB 负相关，r分别是－0.427 和 －0.382(P ＜0.05 或 P ＜0.01)。与 RBC、WBC、G、TC、TG、HDL、LDL、ALP、SCr、BUN、PT 的相关性无统计学意义(P＞0.05，见表2)。

表2 肝纤维化分期与其他参数的相关性()Tab 2 The correlation of the liver fibrosis stages and other indexes()

表2 肝纤维化分期与其他参数的相关性()Tab 2 The correlation of the liver fibrosis stages and other indexes()

2.3 Fisher判别分析 将肝组织学诊断结果分为无纤维化(S0)、肝纤维化(S1～S3)和肝硬化(S4)三类，以单因素分析中 P ＜0.05 的 PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN、HA、ALT、AST、γ-GT、TB、PLT 和 ALB 作为解释变量，逐步法(Stepwise Statistics)进行判别分析，入选判别函数的指标是HA、LN、ALT、PLT。建立判别函数:① Function 1=0.006HA+0.016LN+0.003ALT － 0.007PLT －2.636;② Function 2=0.007LN+0.004ALT+0.021 PLT － 4.763，函数有统计学意义(χ2=39.110，P=0.000)。Function 1、Function 2 的贡献率分别为84.4%和15.6%(见表3)。

表3 Fisher判别的非标化函数系数Tab 3 Unstandardized coefficients of Fisher’s discriminant function

2.4 函数的预测效能 组织学诊断的28例无纤维化患者、106例肝纤维化患者和40例肝硬化患者的二维投影基本明晰，但有少部分重叠现象，中心位置分别是:无纤维化(－1.716，0.887)、肝纤维化(－0.277，－0.387)、肝硬化(1.935，0.404)(见图1)。

根据建立的判别函数，将174例样本的原始参数进行回代，函数诊断无纤维化、肝纤维化和肝硬化的灵敏度分别是75.00%、78.30%和77.50%，总体一致率为77.59%，Kappa 系数为0.610(见表 4)。

3 讨论

用于肝纤维化预测的指标繁多，如年龄、病程、肝病活动的次数和持续时间、病原学指标(HBeAg、HBV DNA)、血清肝纤维化标志物(PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN、HA)、肝功指标(ALT、AST、γ-GT)以及超声影像学指标等均可作为诊断肝纤维化程度的参考依据。本文之所以选择临床常规实验指标建模，是因为这些指标可以在临床上广泛开展，且廉价易得。多项指标的Fisher逐步判别分析结果显示只有HA、LN、ALT、PLT这4个指标入选模型，说明他们是较好的诊断肝纤维化的非创伤性指标组合。相关分析有统计学意义但未入选模型的其他指标并不代表其无实际价值，因为各指标在肝纤维化的不同阶段诊断价值不尽相同，且指标之间存在共线性、样本量少等均是造成多因素分析时不能入选的原因。

表4 肝纤维化的组织学诊断与函数预测结果的对应关系［例数(%)］Tab 4 Correspondence relationship of histological diagnosis and function predicting results for liver fibrosis［n(%)］

图1 174例CHB患者肝纤维化分期的Fisher判别二维投影Fig 1 Fisher’s discriminant two-dimensional projections of liver fibrosis stages in 174 patients with CHB

肝脏细胞外基质(ECM)增多和/或降解减少所致的ECM过度沉积导致了肝纤维化的发生发展。ECM形成与消退是一动态过程，在急性肝损伤时，ECM暂时性产生，修复过程中则明显减少。在慢性持续性肝损伤时，ECM的形成大于降解［8］。有量化研究显示在肝纤维化4项指标(HA、LN、PC-Ⅲ和 C-Ⅳ)中以 HA反映肝纤维化的相关性最好，单纯以HA 110 ng/ml为诊断界值，预测S2及以上级别肝纤维化的敏感性和特异性分别为79%和72%，HA取值190 ng/ml，诊断S4(早期肝硬化)的灵敏度为79%，特异度为93%［9］。本文肝纤维化分期与血清中HA(r=0.569)显著正相关，且相关系数大于LN、PC-Ⅲ和C-IV，说明HA随纤维化程度加剧而逐步增加，可作为推测CHB是否进展成肝纤维化的可靠指标。LN是一种非胶原结构糖蛋白，肝纤维化时肝窦中LN合成、沉积增加，并与肝组织的病理程度显著相关，其血清水平可反映肝窦毛细血管化、汇管区ECM沉积、门脉高压及肝功能受损的情况。本资料也证明了肝纤维化分期与血清LN呈正相关关系(r=0.428)，血清LN升高进一步支持晚期肝纤维化的诊断［10］。ALT是反映肝细胞功能的指标，ALT的升高标志肝脏存在坏死炎症活动［11］。肝纤维化程度与肝组织炎症亦呈正相关关系［12］，因此，ALT对肝纤维化程度的无创伤性判断具有协助作用［13-14］。本文显示肝纤维化分期与PLT负相关，并入选逐步判别分析模型，类似的肝纤维化的无创诊断模型，如APRI指数(AST ×100/PLT)、Fibrotest(α2-巨球蛋白、珠蛋白、γ-GT、总胆固醇、PLT)、Fibrometer(HA、PT、PLT、AST、α2-巨球蛋白、尿素、年龄］、Forns 指数(年龄、γ-GT、总胆固醇、PLT)等均含有PLT变量，以上这些研究均提示PLT联合其他指标可用于肝纤维化的预测。

Fisher判别分析是一种有效的非线性特征提取和分类方法，其基本思想是寻找一个投影方向，使得每一类内的离差最小，而不同类间投影的离差尽可能最大。如此将高维问题降为一维问题来解决，具有直观、明了等特点［15］。本研究将肝纤维化程度分为无肝纤维化(S0)、肝纤维化(S1～S3)和肝硬化(S4)3个级别进行判别分析，所得模型的回代验证结果显示，在28例组织学诊断S0期的患者中，有21例(75.00%)预测正确，106例S1-S3期的患者中，有83例(78.30%)预测正确，40例肝硬化的患者中有31例(77.50%)预测正确，总体一致率为77.59%，Kappa系数为 0.610，说明模型对肝纤维化的诊断有中等能力的参考价值。各类样本的二维投影大部分聚集在相同的区域，但存在部分重叠现象，也说明模型还有进一步改进的必要。

本研究对肝纤维化非创伤性诊断体系的建立做了有效的探索。从临床常用的4个实验室指标中建立了有效区分肝纤维化程度的诊断模型，为CHB患者肝纤维化的筛查提供了一个方便的工具，克服了单一指标检测的不足，指标易从临床实践中获取，操作简便，可重复动态观察。对那些希望免肝活检或有禁忌证的患者，本模型是一种有效的选择，同时也希望医道同仁对本模型验证研究以证实其真实价值。

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