c-Met信号通道参与HGF诱导不同基因型非小细胞肺癌细胞株对吉非替尼耐药

玄香兰 安昌善 周彩存

吉非替尼是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI），是目前最常用的治疗非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）的分子靶向药物。由于吉非替尼对特殊患者的选择性，仅部分NSCLC患者对吉非替尼有效，存在原发或获得耐药，这种耐药机制不十分明确。新近研究[1,2]显示，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）及其受体MET参与NSCLC细胞对吉非替尼耐药。本研究选择NSCLC细胞EGFR突变型PC-9、PC9/R和EGFR野生型H292、A549，用HGF诱导这4株细胞，应用MTT法检测细胞增殖，Annexin V-FITC法检测细胞凋亡，利用蛋白质免疫印迹技术检测c-Met及下游通道蛋白的表达，验证c-Met及下游信号通道参与HGF诱导不同基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药。

1 材料与方法

1.1 材料 人NSCLC细胞株PC9（EGFR突变型，敏感株）、H292（EGFR野生型，敏感株）、PC9/R（EGFR突变型，获得性耐药株）、A549（EGFR野生型，原发性耐药株）均由上海市肺科医院中心实验室提供；吉非替尼原料购自济南汇丰达化工有限公司；HGF购自Humanzyme；MTT粉购自AMRESCO；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit 1购自美国BD；兔抗人p-Met（Tyr1349, 145 kDa）、c-Met（190/56 kDa），p-Akt（Ser473, 60 kDa）、Akt（59 kDa），Erk1（44 kDa），p-Stat3（Ser727, 92 kDa）、Stat3（92 kDa），GAPDH（35 kDa）购自EPITOMICS，p-Erk1/2（Tyr202/Y204, 42/44 kDa）购自CST，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自JECTION；NC膜购自Whatman；ECL化学发光试剂购自Thermo。

1.2 细胞培养 分别将PC9、H292、PC9/R、A549细胞常规培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液中，置于5%CO2、37oC恒温细胞培养箱中培养，每3-4天换液传代1次。

1.3 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的细胞用胰酶消化，每100 μL含细胞数为5×10³个的细胞悬液接种于96孔板。细胞贴壁后，每孔内加入干预药物及细胞因子。72 h后，每孔内加入20 μL MTT（5 mg/mL），放入细胞培养箱中孵育。4 h后，1,200 rpm、10 min离心，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，摇床上混匀约30 min至结晶完全溶解，用酶标仪测量波长530 nm时OD值。细胞存活率=（实验组平均OD值-空白组平均OD值）/（对照组平均OD值-空白组平均OD值）×100%。实验重复3次，用细胞存活率做出量效曲线。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 取1×105个对数生长期细胞接种于6孔板，培养24 h。贴壁后弃原培养液，给予相应药物及细胞因子处理。72 h后，胰酶消化并收集全部细胞到5 mL试管，1,500 rpm、5 min，离心去上清液，生理盐水洗涤1次。加入1×Binding Buffer调整细胞浓度为1×106个/mL，取100 μL（1×105个细胞）到新的5 mL试管。各管内加入5 μL FITC和5 μL PI，室温、避光15 min。上机前加入400 μL 1×Binding Buffer，1 h前进行检测。实验重复3次。

1.5 免疫印迹法检测蛋白表达水平 取对数生长的细胞，给予相应处理后立即冰上裂解细胞，4oC、12,000 rpm、30 min、离心收集各组蛋白裂解液。用BCA蛋白定量法定量。取30 μg-40 μg蛋白经8%-10% SDS-PAGE电泳分离后，转印至NC膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗孵育4oC过夜，TBST洗膜10 min、3次后二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗膜5 min、5次后ECL化学发光试剂显色、曝光成像。

1.6 统计学分析 实验数据用SPSS 17.0统计学软件进行处理。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HGF刺激不同时间段c-Met及其下游通道蛋白水平的变化 以40 ng/mL HGF刺激细胞时间段分别为0 min、15 min、30 min、60 min，裂解细胞取蛋白进行蛋白印迹。结果显示，HGF可活化c-Met及其下游通道蛋白磷酸化，随着时间的推移，各细胞中p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2蛋白含量出现不同程度的变化。PC9，H292和PC9/R，A549细胞的最佳HGF刺激时间段分别于60 min、30 min、15 min时比其他时间段c-Met及其下游通道磷酸化蛋白表达明显（图1）。

2.2 吉非替尼或/和HGF处理的药物浓度-生长曲线 吉非替尼浓度分别取0 μmol/L、0.01 μmol/L、0.04 μmol/L、0.1 μmol/L、0.4 μmol/L、1 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L，根据MTT法检测结果，吉非替尼作用于HGF诱导PC9、H292、A549细胞的药物浓度-细胞存活率曲线与非诱导曲线相比明显往右侧移位，PC9/R细胞则未见移位（图2）。吉非替尼对HGF诱导PC9、H292细胞的半数抑制浓度（IC50）至少提高100倍，A549细胞的IC50至少提高2倍，PC9/R细胞的IC50则无明显差异（表1）。

2.3 吉非替尼或/和HGF处理对细胞凋亡的影响 每种细胞分为四个实验组：对照组（C）、HGF组（H）、吉非替尼组（G）、HGF和吉非替尼组（HG）。以40 ng/mL HGF与1 μmol/L吉非替尼单用或联合作用48 h后检测细胞凋亡率。根据表2显示，PC9、H292、A549细胞的HG组与G组相比，凋亡率明显减少，有统计学意义（P＜0.05）。PC9/R细胞的HG组与G组凋亡率无明显差异（P＞0.05）。

2.4 吉非替尼或/和HGF处理对细胞c-Met及其下游蛋白表达的影响 首先细胞饥饿过夜，1 μmol/L吉非替尼处理24 h，继续以40 ng/mL HGF刺激PC9细胞1 h、H292和PC9/R细胞30 min、A549细胞15 min后裂解细胞提取蛋白，进行免疫印迹。根据免疫印迹结果，HGF均能刺激PC9、H292、PC9/R、A549细胞中p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2的活性。吉非替尼与HGF共同处理时，不同细胞间c-Met及其下游通道蛋白表达有差异。在PC9、H292、A549细胞，吉非替尼均能抑制非HGF诱导细胞内p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2的活性，而不能抑制HGF诱导细胞内p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2的活性。在PC9/R细胞，吉非替尼均能抑制HGF非诱导及诱导细胞内p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2的活性。在4种细胞中，无论是否HGF诱导，吉非替尼均能抑制ErbB3的活化（图3）。

表1 HGF诱导前后吉非替尼半数抑制浓度（IC50）Tab 1 Gefitinib IC50 before or after being induced by HGF

表2 HGF诱导耐药对细胞凋亡的影响Tab 2 The apoptosis in resistance induced by HGF

图1 HGF（40 ng/mL）诱导不同时间c-Met及其下游通道磷酸化的表达Fig 1 The phosphorylation of Met and downstreams signaling pathways induced by HGF (40 ng/mL) in different time

图2 吉非替尼或/和HGF处理的浓度-存活率曲线。A、B、D：HGF诱导时曲线往右移；C：HGF诱导时曲线无右移。Fig 2 The concentration-survival curve when treated with gefitinib or/and HGF. A, B, D: curve shifts right when induced by HGF; C: curve no shifts right when induced by HGF.

图3 HGF诱导耐药对Met及其下游通道蛋白的影响Fig 3 The phosphorylation of Met and downstreams signaling pathways in resistance induced by HGF

3 讨论

EGFR-TKIs对部分特殊患者有效，非选择的NSCLC患者有效率只有20%[3]。EGFR基因类型与EGFR-TKIs有效率有很大的相关性，突变型患者中70%-75%有效[4]，野生型患者中10%-15%有效[5]，存在原发或获得性耐药，提示并非所有突变株对吉非替尼敏感，也并非所有野生株对吉非替尼耐药。本研究选择的4种NSCLC细胞分别具有以下特点：PC9细胞是EGFR基因外显子19缺失，故吉非替尼对其IC50值为（0.05±0.02）μmol/L；PC9/R细胞是PC9细胞诱导耐药株，同样存在EGFR基因外显子19缺失，但吉非替尼对其IC50值为（7.19±1.05）μmol/L，比敏感株耐药100倍以上；H292细胞是EGFR基因野生型，吉非替尼对其IC50值为（0.11±0.05）μmol/L；A549细胞同样是EGFR基因野生型，但吉非替尼对其IC50值为（37.5±1.89）μmol/L。也就是说PC9和H292细胞是不同EGFR基因型的敏感株，PC9/R和A549是不同EGFR基因型的耐药株。

EGFR二次突变（T790M）和MET基因扩增是目前EGFR-TKIs获得性耐药的两大主要分子机制，其他可能的机制有胰岛素样生长因子1受体过表达[6]、蛋白酪氨酸磷酸酶基因（PTEN）缺失[7]、HGF高表达[8]等，有待进一步体内外实验研究证实。HGF是成纤维细胞的衍生因子，在NSCLC患者血清中含量明显升高，与肿瘤的侵袭状态密切相关[9]。HGF与其特异性受体c-Met结合而发挥作用，异常的HGF/c-Met信号途径与肿瘤细胞生长、运动、粘附、转移、凋亡等因素相关。本研究中，除了PC9/R细胞，吉非替尼对PC9、H292、A549的生长抑制作用呈浓度依赖性，HGF诱导后吉非替尼抑制细胞的生长曲线往右移。HGF诱导后吉非替尼对PC9、H292、A549细胞的IC50值明显升高，吉非替尼对HGF诱导的细胞凋亡率比非诱导细胞明显减少。提示HGF明显提高了吉非替尼IC50值，使不同基因型肺癌细胞存活率升高。

HGF与c-Met结合后c-Met发生自身磷酸化，激活细胞内各种重要信号通路，最后调控细胞的一系列生命活动。Met下游通道包括MAPK、PI3K/Akt 和c-Src/FAK、STAT等通路，其中MAPK通路主要调控细胞分散及增殖，PI3K/Akt通路主要调控细胞活力及存活，c-Src/FAK通路主要调控细胞粘附及转移，STAT通路主要调控细胞形态发生。本文中HGF刺激不同时间段，HGF在短时间（15 min-60 min）内即可活化c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2，且其含量高低不一。分别与其他时间段比较，PC9细胞于1 h、H292和PC9/R细胞于30 min、A549细胞于15 min时c-Met及其下游通道蛋白磷酸化含量最高。

本文中，吉非替尼在无HGF刺激下明显抑制PC9、H292、A549细胞细胞内Akt、Stat3、Erk1/2的活化，但在HGF诱导下不能抑制PC9、H292、A549细胞内c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2活化，同时检测的非磷酸化的c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2总量无明显变化。说明c-Met及其下游通道蛋白磷酸化参与了吉非替尼耐药机制。在PC9/R细胞中，HGF虽能活化c-Met及下游信号蛋白，但与吉非替尼共同处理时不能持续活化c-Met下游通道，这与MTT及凋亡结果相符，其原因有待进一步研究。本文结果提示，HGF诱导的吉非替尼耐药需要上游蛋白的参与，也需要其下游信号蛋白的参与。Bean等[10]报道在吉非替尼获得性耐药患者中检测到MET基因高扩增，明确MET基因扩增激活ErbB3/PI3K/Akt信号途径，绕过吉非替尼治疗的靶点，导致NSCLC对吉非替尼产生耐药。本研究中，虽然HGF诱导c-Met/Akt信号途径活化，但未见ErbB3活化，提示ErbB3可能不参与HGF诱导的不同基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药。