反复冻融法辅助提取油菜花粉多糖的研究

郭卫芸，刘海英，白玉敏，杨公明

（1.许昌学院食品科学与工程学院，河南许昌 461000；2.西华大学生物工程学院，四川成都 610039；3.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

反复冻融法辅助提取油菜花粉多糖的研究

郭卫芸1，刘海英1，白玉敏2，杨公明3，*

（1.许昌学院食品科学与工程学院，河南许昌 461000；2.西华大学生物工程学院，四川成都 610039；3.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

摘 要：通过对加水量、冻结时间、解冻温度、冻融次数等进行单因素试验及正交试验，验证反复冻融法对油菜花粉中多糖的辅助提取效果，确定最佳处理条件为：加水量40 mL/100 g，冻结时间4 h，解冻温度80℃，冻融次数2次，在此条件下，油菜花粉可溶性多糖溶出率可达到21.79%。

关键词：油菜花粉；多糖；反复冻融；提取

油菜为十字花科芸苔属中用于采籽榨油的植物，其花粉呈黄色，多数为近球形或长球形，表面呈颗粒状，形体大且外壁薄、清香、无怪味[1]。花粉营养丰富，碳水化合物占40%～50%，其中绝大多数是多糖，长期合理食用花粉，可明显增强体质、提高免疫力、延缓衰老[2]。我国是世界养蜂大国，蜂花粉年产量约1 500 t，居世界首位，但花粉资源利用率却很低，开发花粉食品具有广阔的市场前景和巨大的潜在价值[3]。由于花粉壁结构复杂，组织致密，对花粉营养物质的溶出起到较强的阻碍作用[4-6]。因此，研究合适的破壁工艺，对于提高多糖的得率意义重大。本研究主要验证反复冻融法对花粉破壁的有效性，并试验确定合适的处理条件。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

油菜花粉：许昌地区市售；葡萄糖（标准品）；苯酚（分析纯）；硫酸（分析纯）；95%的乙醇（分析纯）；YP2002型电子分析天平、BlueStar型紫外-可见分光光度计：莱伯泰科有限公司；TG16-WS台式离心机：湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流程及操作要点

1.2.1.1 流程

油菜花粉→加水溶胀→慢速冷冻→水浴中快速解冻→加水→搅拌→静置1 h→离心→取上清液→定容[7]→测定多糖

1.2.1.2 操作要点

1）油菜花粉

要求油菜花粉籽粒饱满，色泽金黄，无虫蛀，无霉斑，并去除砂粒等杂质。各组取5 g花粉置于准备好的保鲜袋上。

2）加水溶胀

按照各组试验要求快速准确的加一定量水，用保鲜袋将花粉包住密封，并轻轻揉揉之后室温下放置30 min，使水分充分渗入到花粉中。

3）反复冻融

按照各组试验要求在冰箱中缓慢冷冻一定时间后，取出，迅速放在水浴锅中溶解，如此反复。

4）可溶性糖的溶出

将反复冻融后的花粉全部取出置于离心管中，加水15 mL并将花粉用玻璃棒轻轻捣碎，使溶液充分混合，室温下放置1 h。

5）离心

以3 000 r/min的速度对上述溶液离心20 min。

6）定容

取离心后的上清液，定容至250 mL。

1.2.2 多糖含量的测定

利用苯酚-硫酸法测定多糖[7-9]。

1.2.2.1 标准曲线的绘制

准确吸取葡萄糖标准溶液（0.1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分别置于试管中，各加入蒸馏水，使其体积为2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，并迅速滴加浓硫酸5.0 mL，静置10 min，充分振荡摇匀之后静置20.0 min。另外以蒸馏水2.0 mL，加苯酚和浓硫酸，同上述操作做空白对照，于波长490 nm处测吸光度值，得标准曲线，如图1。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

1.2.2.2 可溶性多糖溶出率测定

按1.2.1工艺处理样品后，将得到的花粉上清液进行100倍稀释，取稀释后的样品2.0 mL，经上述处理后测定吸光值，并计算可溶性多糖溶出率。

式中：A为试样的吸光度；V为样液的体积，mL；M为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 加水量对油菜花粉可溶性多糖的溶出率的影响

共设 5个加水量处理，分别为 10、20、30、40、50 mL/100 g，每个处理重复2次。并在冻结时间3 h、冻结温度-30℃、解冻温度80℃、溶解时间20 min及反复冻融3次的条件下冻融，测定可溶性多糖溶出率，结果如图2。

图2 加水量对油菜花粉可溶性多糖溶出率的影响Fig.2 Effect of water addition to content of soluble polysaccharides

由图2可以看出，可溶性多糖的溶出率随加水量的增加先呈快速上升，后趋于平缓的趋势。这主要是因为花粉中的水冻结形成冰晶体，加热融化可以产生张力，从而破坏花粉壁的组织结构，而细胞内外的水分直接关系到冰晶体量的大小。当加水量为30 mL/100 g时可溶性多糖达到20.55%，加水量再继续增加，可溶性多糖溶出率变化不大，说明在加水量为30 mL/100 g时水分完全填充了细胞内部间隙，导致在冻融过程中冰晶体对细胞的机械作用发挥到最大。

2.2 解冻温度对油菜花粉可溶性多糖的溶出率的影响

共设5个解冻温度处理，分别为60、70、80、90、100℃，每个处理重复2次。在加水量为20mL/100 g、冻结时间3 h、冻结温度-30℃、溶解时间20 min及反复冻融3次的情况下冻融，测定可溶性多糖溶出率，结果如图3。

由图3可知，解冻温度对油菜花粉可溶性糖溶出率影响较显著。在温度低于80℃时，可溶性多糖溶出率随着温度的升高而升高。当温度超过了80℃后，可溶性多糖溶出率急剧减少，有人在进行乌龙茶多糖提取研究时也得到了相似的结果[10]。分析认为，温度过高时，可能会使花粉多糖降解。而温度太低，细胞破壁率低，多糖溶出不完全。可以认为油菜花粉破壁的解冻温度在80℃较为合适。

图3 解冻温度对油菜花粉可溶性多糖溶出率的影响Fig.3 Effect of defrosted temperature to content of soluble polysaccharides

2.3 冻融次数对油菜花粉多糖溶出率的影响

共设 5个冻融次数处理，分别为 0、2、3、4、5次，每个处理设2个重复。在加水量为20 mL/100 g、冻结时间3 h、冻结温度-30℃、溶解时间20 min及解冻温度80℃的条件下进行冻融，测定可溶性多糖溶出率，得结果如图4。

图4 冻融次数对油菜花粉可溶性多糖溶出率的影响Fig.4 Effect of repeated freezing and melting times to content of soluble polysaccharides

根据图4可知，随着冻融次数的增多，油菜花粉可溶性多糖的溶出率逐渐增大。但开始时油菜花粉可溶性多糖的溶出率增大的幅度较大，在超过3次后，其多糖溶出率增大的幅度较缓慢。分析认为，经过3次冻融，大部分油菜花粉的细胞结构已被破坏。

2.4 冻结时间对油菜花粉多糖溶出率的影响

共设 5 个冻结时间处理，分别为 0、2、3、4、5 h，每个处理设2个重复。在加水量为20 mL/100 g、冻结温度-30℃、溶解时间20 min、解冻温度80℃及反复冻融3次、的条件下冻融，测定可溶性多糖溶出率，结果如图5。

根据图5可知，在试验条件下，随着冻结时间的增多，油菜花粉可溶性多糖的溶出率逐渐增大，当冻结时间超过3 h后，多糖溶出率增大的幅度开始缓慢。分析原因可能是在冻结3 h时，油菜花粉的细胞壁已被破坏，致使大部分可溶性多糖可以突破细胞壁三维网状结构的束缚而溶出。冻结时间加长，花粉多糖溶出率增加也缓慢。

图5 冻结时间对油菜花粉可溶性多糖溶出率的影响Fig.5 Effect of freezing time to content of soluble polysaccharides

2.5 正交试验

为选择反复冻融法破壁油菜花粉的最佳工艺条件，设计以加水量、解冻温度、冻融次数、冻结时间为考察因素，以油菜花粉可溶性多糖的溶出率为考查目标的L9（34）正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

经过试验，结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Result of orthogonal test

由表2可知各因素对油菜花粉可溶性多糖溶出率的影响作用是不同的，4个因素对油菜花粉可溶性多糖溶出率的影响大小顺序依次为：B＞C＞A＞D。经过极差分析发现，反复冻融法对油菜花粉破壁的最佳工艺组合为A3B3C1D3，即：加水量40 mL/100 g，冻结时间4 h，解冻温度80℃，冻融次数2次时，油菜花粉可溶性多糖溶出率较高。在此工艺条件下做验证试验，得到3组数据：21.82%、21.75%、21.80%，验证的平均值为21.79%。

3 结论

1）各因素对油菜花粉可溶性多糖溶出率的影响顺序为：冻结时间＞冻融次数＞解冻温度＞加水量。

2）反复冻融法破壁油菜花粉最佳的工艺组合是：加水量40 mL/100 g，冻结时间4 h，冻融次数2次，解冻温度80℃，在此条件下，油菜花粉可溶性多糖溶出率可达到21.79%。

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Technics of Extracting Polysaccharides from Rapeseed Pollen with Repeated Freezing and Thawing Method

GUO Wei-yun1，LIU Hai-ying1，BAI Yu-min2，YANG Gong-ming3，*
（1.College of Food Chemistry and Engineering，XuChang University，Xuchang 461000，Henan，China；2.School of Bioengineering ，Xihua Ucniversity，Chengdu 610039，Sichuan，China；3.College of Food Science，South China Agricultual University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

Abstract：Rapeseed pollen was taken as the main raw material and repeated freezing and thawing method was adopted to break the wall of the pollen.The effects on the wall-broken of the rapeseed pollen made by the water content， freeze time， defrosting degree， freezing-thawing times was studied.Through the orthogonal test， the water content was 40 mL/100 g，the freeze time was 4 hours，the defrosting was 80℃，the freezing-thawing was twice.Under the optimal conditions，the dissolving rate of soluble polysaccharide of the rapeseed pollen was 21.79%.

Key words：rapeseed pollen；polysaccharides；repeated freezing and thawing method；extracting

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.007

许昌学院优秀青年骨干教师资助项目；许昌学院科研基金（2013063）

郭卫芸（1981—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：农产品贮藏与加工。

2012-10-29