响应曲面法优化超声辅助提取化橘红总黄酮

王雯，上官新晨，蒋艳，侯秀娟，沈勇根

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室江西南昌 330045）

响应曲面法优化超声辅助提取化橘红总黄酮

王雯，上官新晨，蒋艳，侯秀娟，沈勇根*

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室江西南昌 330045）

摘 要：研究了响应曲面法超声辅助提取化橘红中黄酮化合物的工艺。在单因素实验的基础上，对总黄酮提取进行优化。选择乙醇体积分数，料液比，超声功率，超声温度四因素，采用Box-behnken设计方法，研究自变量及其交互作用对总黄酮提取率的影响。利用Design Expert 6.0.1软件对数据进行回归分析，得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明化橘红总黄酮的最优提取条件是乙醇体积分数30%，料液比1∶100 g/mL，超声功率150 W，超声温度80℃。在此条件下，获得化橘红黄酮最大得率为0.884%。

关键词：化橘红；响应曲面法；总黄酮；超声辅助提取

中药化橘红（Exocarpium citri Grandis）又名“化州橘红”、“化州陈皮”、“柚皮橘红”等，是由芸香科（Rutaceae）植物化州柚（Citrus grandis（L.）Osbeck var．tomentosa Hort.）或柚（Citrus grandis（L）Osbeck）未成熟果实或近成熟的干燥外层果皮。为较常用的中药，临床习惯称化州柚为毛橘红或者光橘红。未成熟果实入药可治疗多种疾病[1]，如化痰理气、健胃消食、治胸中痰滞，咳嗽气喘、呕吐呃逆、饮食积滞等证[2]。化橘红黄酮类化合物的主要有效成分是柚皮苷，除此之外还有少量的野漆树苷（rhoifolin）、新橙皮苷（neohes．peridin）、枳属苷（poncirin）等。本实验研究的化橘红来源于修水县，目前国内主要对广州化橘红研究较多，修水化橘红研究鲜有报道。

超声波提取法已经广泛应用到植物有效成分提取中[3-4]。现普遍认为其空化效应、热效应和机械作用是超声技术在中药提取中的三大种作用机制[5-6]。本实验通过超声波辅助提取化橘红总黄酮，采用响应曲面设计对其提取工艺进行优化。传统的正交试验方法虽然能够同时考虑几种影响因素，寻找最佳因素水平组合，但是在实际应用中，难免会有诸多局限性，尤其在寻找因素和响应值之间的函数关系尚显不足[7-12]，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值[13]。响应曲面法是一种优化过程的统计学实验方法，利用此方法可以建立连续变量曲面模型，对影响过程的因子及其交互作用进行评价，弥补了统计的单变量优化实验的不足，并且在工业研究中得到了广泛应用[14]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

化橘红：由江西华昂实业有限公司提供；芦丁标准品（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯），石油醚（分析纯），亚硝酸钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；硝酸铝（分析纯）：天津市兴复精细光化研究所；氢氧化钠（分析纯）：天津市福晨光学试剂厂。

1.2 仪器与设备

723C可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；数显恒温水浴锅：HH-2国华电器有限公司；KQ3200DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；BSA124S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 化橘红总黄酮的分析测定方法

1.2.1 供试品的制备

取化橘红粉末（过30目筛）200 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚（60-90）500 mL，加热水浴回流提取4 h，弃去石油醚，将样品中残存的石油醚全部挥去，待用。

1.2.2标准曲线绘制

精密称取120℃烘干至恒重芦丁标准品20 mg，用体积分数为60%的乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，摇匀即得质量浓度为0.20 mg/mL的芦丁标准溶液，用移液管分别精密移取芦丁标准液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加入质量分数为5.0%的NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置5 min，后加入质量分数为10%的Al（NO）31.0 mL，摇匀，放置5 min，再加入质量分数为4%NaOH溶液4 mL，用体积分数60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置10 min后，分别以试剂空白和60%乙醇为参比，于510 nm波长处分别测定其吸光度，以吸光度对芦丁质量浓度进行线性回归，得回归方程。

1.2.3样品中黄酮化合物含量的测定

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

准确称取样品1 g于三角瓶中，超声提取后，抽滤，移取30 mL滤液定容至100 mL容量瓶中，摇匀。移取10 mL于25 mL容量瓶中，用1.2.1的方法测定其在510 nm的吸光度，然后按照下式计算化红中黄酮类化合物的得率。

黄酮得率（%）=C×a×V／w×100%

式中：C为提取液黄酮物质的质量浓度，（mg/mL）；a为稀释倍数；V为提取液体积，mL；w为化橘红粉末质量。

1.3方法

1.3.1单因素实验

影响超声的因素很多，在预实验中对超声温度、超声时间、超声功率、料液比、乙醇的体积分数和超声提取次数进行考察。按照1.2.3的方法提取化橘红总黄酮，并计算得率。

1.3.2 响应曲面法试验设计

在单因素试验的基础上选择对响应值（总黄酮得率）有显著影响的因素：超声温度，超声功率，料液比，乙醇浓度，其它条件为单因素试验的最佳条件，即超声时间50 min，提取次数1次，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计四因素三水平试验方案，利用Design Expert软件对试验数据进行回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声温度对提取的影响

超声温度对提取的影响见图2。

随着提取温度的升高，黄酮得率增加，在70℃时达到最大值，而在80℃时黄酮的得率下降，温度过高接近乙醇的沸点，可能会影响黄酮类物质的溶出量。这可能是由于高温会引起细胞膜结构变化，从而使黄酮容易转移到溶液中，但过高的温度又会引起黄酮物质结构发生变化，破坏黄酮物质[15]。

图2 超声温度对黄酮得率的影响Fig.2 Effect the ultrasonic temperature on extraction rate of total flavones

2.1.2 超声时间对提取的影响

超声时间对提取的影响见图3。

图3 超声时间对黄酮得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic treatment time on extraction rate of total flavones

超声时间在10 min～50 min时，黄酮得率随着时间的延长缓慢上升，在50 min的时候黄酮的得率最大，当时间在50 min～70 min时黄酮得率出现降低的趋势，由于有效由于有效成分浓度差是超声提取的主要推动力，在提取初期，有效成分浓度差大，因此提取速率快，提取率增加明显，随着提取时间的延长，溶剂中有效成分浓度逐渐增大，和固相中的浓度差逐渐变小，也就是推动力变小，所以提取速率慢慢减慢[16]。当时间从70 min～90 min时，随着超声时间的延长，可能溶出其它的杂质，影响黄酮得率。

2.1.3 超声功率对提取的影响

超声功率对提取的影响见图4。

随着超声功率的增大，黄酮得率也呈上升趋势，这是因为超声功率的增加，提取的推动力增大，使得被萃取出来的黄酮化合物的量也随之增多。对一定频率和一定发射面的超声来说，功率增大，声强随之增大。如果声强增大，声压幅值以及液体中相应负压力亦增大，造成空化泡的半径逐渐增大至极限，空化泡崩溃所需的时间将变得更短，也就是说单位时间内超声产生的空化事件增多，从而有利于植物药有效成分提取率的提高[16]。

图4 超声功率对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of the ultrasonic power on extraction rate of total flavones

2.1.4 料液比对提取的影响

料液比对提取的影响见图5。

图5 料液比对黄酮得率的影响Fig.5 Effect of liquid to solid ratio on extraction rate of total flavones

乙醇用量的增加有助于黄酮类化合物的浸出，由于化红粉末与提取液接触面的浓度增大，溶剂中溶质的浓度差和溶剂能够溶解的物质的量在不断增大所致，溶剂用量少，不容易提取完全，但料液比过大，黄酮得率随之下降，而且也会导致提取成本提高，给后续的浓缩和纯化工作带来压力。所得料液比的趋势图与超声提取苦荞总黄酮和火麻仁总黄酮的趋势图相似[17-18]。

2.1.5 乙醇体积分数对提取的影响

乙醇体积分数对提取的影响见图6。

由图6可知，乙醇体积分数对黄酮得率影响较大，不同体积分数的乙醇极性不同，根据相似相溶原理，当体积分数为40%时，黄酮得率最高，这可能是因为大量的水可以有效膨胀化橘红组织，增大溶质与溶剂接触面积，降低溶剂的黏度，加速溶质扩散，但是当乙醇体积分数过大时，沸点下降，导致挥发增大，同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性的成分溶出量增加，与黄酮化合物竞争，从而导致黄酮化合物得率下降。所得结论的趋势图与朱金霞[19]提取苦豆子黄酮和田英娟[20]超声提取橄榄总黄酮相近。

图6 乙醇体积分数对黄酮得率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavones

2.1.6 提取次数对提取的影响

提取次数对提取的影响见图7。

图7 提取次数对黄酮得率的影响Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of total flavones

图7表明，提取1次与提取2次之间差异极显著，提取2次和3次之间差异不显著。提取1次时，化橘红总黄酮得率明显高于2次、3次，说明原料经两次提取其中的黄酮物质已经大部分被提出来[21]，因此最佳提取效果为1次。

2.2 响应曲面试验结果分析

响应曲面法的试验设计方案见表1和实验结果见表2。

表1 Box-Behnken响应曲面设计及结果Table 1 Box-Behnken response surface design matrix and experimental results

续表1 Box-Behnken响应曲面设计及结果Continue table 1 Box-Behnken response surface design matrix and experimental results

表2 回归模型的方差分析Table 2 Variance analysis for the established regression model

对表试验数据进行多元回归拟合，得到响应曲面二次多元回归模型方程：

式中：Y 代表化橘红总黄酮得率，A、B、C、D、分别代表超声温度，超声功率，料液比，乙醇浓度。

对该模型进行方差分析，结果见表2。由表2可知，模型具有高度显著性（P＜0.000 1），失拟项（P=0.382 8＞0.05）不显著，模型的复相关系数R2=0.920 4，说明该模型能解释92.04%的响应值变化，即该模型与实际实验拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型对实验进行分析和预测。由回归模型的系数显著性检验可知，模型的一次项A、B、C对化橘红中黄酮提取的线性效应极显著，二次项B2、C2、D2对化橘红中黄酮提取的线性效应极显著，二次项AD对化橘红中黄酮提取的线性效应显著。因此，该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以用其确定最佳提取工艺条件。

图8～图11是各因子交互作用的响应曲面的3D分析图。

图8 超声温度与料液比对黄酮得率影响的曲面图Fig.8 Surface chart of response on effect the ultrasonic temperature and liquid to solid ratio on the flavonoid yield

图9 超声温度与乙醇体积分数对黄酮得率影响的曲面图Fig.9 Surface chart of response on effect the ultrasonic temperature and ethanol concentration on the flavonoid yield

图10 超声功率与乙醇浓度对黄酮得率影响的曲面图Fig.10 Surface chart of response on effect the ultrasonic power and ethanol concentration on the flavonoid yield

图11 料液比与乙醇浓度对黄酮得率影响的曲面图Fig.11 Surface chart of response on effect liquid to solid ratio and ethanol concentration on the flavonoid yield

图8表明，超声温度升高，黄酮得率增加，当料液比达到1∶95 g/mL左右，黄酮的得率会略有降低。图9表明，超声温度与乙醇体积分数之间交互作用不明显，提取温度不变，化橘红总黄酮得率随乙醇体积分数的增大而增大，达到峰值后，总黄酮的得率随着乙醇浓度增大而减小。图10表明，黄酮得率随超声功率增加呈上升趋势，黄酮得率与乙醇体积分数具有二次抛物线关系。乙醇体积分数在30%～40%附近出现峰值，根据相似相溶原理可知，化橘红黄酮极性与此范围乙醇溶液的极性相当。图11表明，乙醇体积分数和料液比交互作用明显，化橘红总黄酮得率随着乙醇体积分数的增加而增大，在低乙醇体积分数和高乙醇体积分数时，黄酮得率较低，料液比的增加能降低提取溶液中黄酮的含量，从而增加料液比两相黄酮的浓度梯度，进而提高化橘红黄酮溶出的速度，最终提高得率[22]，但是料液比过高，也会降低黄酮得率。

在选取的各因素范围内，根据回归模型通过Design-expert软件分析得到化橘红总黄酮的最佳提取条件是超声温度79.37℃，超声功率149.02 W，料液比96.58 g/mL，乙醇浓度31.21%，总黄酮得率的预测值为0.903 8%。为了验证响应面法的可行性，采用修正的最佳提取条件：超声温度79℃，超声功率150 W，料液比100 g/mL，乙醇浓度30%，进行化橘红黄酮验证实验，重复三次，求平均值，得到化橘红总黄酮的得率为0.884%，与预测值基本一致，验证了实验模型的可行性，说明响应曲面法优化化橘红黄酮提取条件是可行的，所得的黄酮提取条件具有实际应用价值。

3 结论

在单因素试验的基础上通过响应曲面法建立了一个超声提取化橘红总黄酮二次项回归模型，经检验证明合理可靠。获得超声提取化橘红总黄酮的最佳工艺条件为超声温度79.37℃，超声功率149.02 W，料液比96.58 mL/g，乙醇浓度31.21%，化橘红总黄酮得率为0.903 8%。经验证结果稳定，是一种较优的提取化橘红黄酮的工艺方法，为化橘红黄酮的开发利用提供理论参考。

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[1]李润唐,张映南,李映志,等.化橘红研究进展[J].广东林业科技，2008(2):82-85

[2]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京:化学工业出版社,2005:149

[3]Vilkhu R,Mawson L,Simons D,et al.Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry-A review[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2008,9(2):161-169

[4]Wang J,Sun B,Cao Y,Tian Y,et al.Optimisation of ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds from wheat bran[J].Food Chemistry,2008,106(2):804-810

[5]胡爱军,杨日福,丘泰球,等.超声强化超临界流体萃取装置的设计及应用[J].声学技术，2005,24(3):178-180

[6]贲永光,丘泰球,闫杰.双频超声强化从海金沙中提取黄酮的实验研究[J].声学技术,2006,25(3):209-213

[7]LIU Shucheng,YANG Feng,ZHANG Chaohua,et al.Optimization of process parameters for supercritical carbon dioxide extraction of Passiflora seed oil by response surface methodology[J].The Journal of Supercritical Fluids,2009,48(1):9-14

[8]王明艳,杨凡,李燕,等.响应面法优化百部多糖提取条件研究[J].食品科学,2009,30(6):80-83

[9]许晖,孙兰萍,张斌,等.响应面法优化花生壳黄酮提取工艺的研究[J].中国粮油学报,2009,24(1):107-111

[10]LIANG R J.Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra polysaccharides by response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2008,74(4):858-861

[11]ALESSANDRA L,ELIANA S,JOSE A.Response surface analysis of extract yield and flavour intensity of Brazilian cherry(Eugenia uniflora L.)obtained by supercritical carbon dioxide extraction[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2009,10(2):189-194

[12]周燕芳,丁利君.超声波辅助提取艾叶黄酮的工艺研究[J].食品与机械,2006,22(4):39-41

[13]刘春泉,宋江峰,李大婧,等.响应曲面法优选灵芝子实体多糖的提取工艺[J].江苏农业学报，2007，23(3):239-243

[14]Bahadir K.Response surface methodology(RSM)analysis of photoinduced decoloration of toludine blue[J].Chemical Engineering Journal,2008，136(1):25-30

[15]郭辉,罗宇倩,章华伟,等.响应曲面法优化超声辅助提取荷叶黄酮工艺研究[J].中国食品学报，2011，11(1):119-125

[16]贲永光,丘泰球,李康,等.超声强化溶剂提取车前草中总黄酮的研究[J].声学技术，2009，28(2):133-136

[17]王军,王敏,宋旭辉,等.响应曲面法优化苦荞麸皮总黄酮的提取工艺[J].西北农林科技大学学报，2006，34(12):189-194

[18]赵翾,李红良,张惠妹.响应面法优化火麻仁黄酮提取工艺[J].食品科学,2011,23(2):127-131

[19]朱金霞,郭生虎,郑国保.超声波法优选苦豆子中总黄酮的提取工艺研究[J].中国野生植物资源,2010,29(5):35-38

[20]田应娟,朱良,陈健,等.超声强化提取橄榄黄酮类物质及其抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2011，32(1):17-22

[21]许瑞波,赵跃强,鲁升丽,等.山楂叶黄酮的超声提取、精制及抗氧化性研究[J].食品研究与开发,2007,128(4):64-69

[22]许晖,孙兰萍,张斌,等.响应面法优化花生壳黄酮提取工艺的研究[J].中国粮油学报,2009,24(1):106-110

Ultrasound-assisted Extraction of Total Flavonoids From Exocarpium Citri Grandis with Response Surface Methodology

WANG Wen，SHANGGUAN Xin-chen，JIANG Yan，HOU Xiu-juan，SHEN Yong-gen*
（Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food，College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，Jiangxi，China）

Abstract：The ultrasonic-assisted extraction process of flavonoids from Exocarpium citri Gandis was studied.Based on the experiment of single factor to optimize extraction yield of total flavonoids.The effects of the ethanol concentration，ratio of the liquid to solid，the ultrasonic power and the ultrasonic temperature were studied with Box-behnken design and their interactive effect on the extraction rate of total flavonoids were also investigated.The predictive model of polynomial quadratic equation was analysed by Design Expert software （6.0.1.）.The results showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids from Exocarpium citri Gandis were ethanol concentration 30%，ratio of the liquid to solid 1∶100 g/mL，the ultrasonic power 150 W，extraction temperature 80℃.Under these conditions，the predicted value of extraction yield of total flavonoids was 0.884%.

Key words：ExocarpiumcitriGrandis；responsesurfacemethodology；totalflavonoids；ultrasonic-assisted extraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.009

江西省教育厅“修水化橘红止咳化痰功效成分研究”项目(GJJ11404)；修水华昂实业有限公司横向课题

王雯（1985—），女（汉），研究生，研究方向：食品科学。

沈勇根（1971—），男，副教授，硕士，研究方向：食品科学。

2012-11-10