猪源高产蛋白酶芽胞杆菌的分离与鉴定

李三栋，丁 轲,*，罗伟光，彭春平，孙二刚，刘永垒

（1.河南科技大学宏翔发酵饲料实验室，河南 洛阳 471003；2.河南宏翔生物科技有限公司，河南 汝州 467500）

蛋白酶广泛存在于人和动物的消化道中，对蛋白质的消化吸收起着至关重要的作用。猪日粮中蛋白质含量一般为13%～17%，蛋白质能被消化降解多少将直接影响着动物生产性能和经济效益，而蛋白质必需经过蛋白酶降解成短肽或氨基酸后才能被动物利用。一般成年猪能够分泌足够的蛋白酶消化蛋白质，但仔猪消化机能尚未发育完全，蛋白酶分泌量不足，在一定程度上影响了其生长速度，所以在仔猪日粮中添加外源蛋白酶不但能补充体内内源酶不足，而且能激活内源酶分泌，将蛋白质分解成多肽、寡肽或氨基酸等，有利于仔猪对蛋白质的消化分解和吸收利用。目前虽然已开发出多种蛋白酶制剂，但由于菌种酶活力低、生产成本高，因而有关蛋白酶饲料营养方面有待进一步研究。本试验从不同地区来源的猪粪样品中分离产蛋白酶芽孢杆菌，旨在筛选高产蛋白酶菌株，同时也筛选适合作为饲料添加剂的产蛋白酶芽孢杆菌，为实践中提供产酶益生菌奠定基础。

1 试验材料

1.1 试验样品

分别从河南省各地区采集猪粪便样品80份。

1.2 培养基

分离培养基：酪蛋白0.5%，脱脂奶粉0.5%，酵母膏0.2%，琼脂2%，调pH至7.5。发酵培养基：牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.5%，琼脂1.5%，调pH至7.5。

1.3 主要试剂

微量生化发酵管：葡萄糖、蔗糖等36种发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司；PCR试剂：Taq酶（5 U·μL-1）、DL2000、Goodview、琼脂糖凝胶均购自北京方宝生物科技有限公司；引物：参考芽孢杆菌的16S rDNA序列设计一对引物，由上海生物工程有限公司合成，P1：5'-CTGCAGCTA CC GGTCGCCACCATG-3'， P2： 5'-GAATTCTTAC TT GTACAGCTCGTCCATG-3'。

2 试验方法

2.1 样品采集及处理

将分别从河南省各地区采集猪粪便样品80份装入样品袋内，4℃保存备用。取样品约1 g加入10 mL无菌水中，制成10%的混悬液，80℃水浴热处理30 min。

2.2 产蛋白酶菌株初筛、纯化

将处理过的上清液稀释到一定浓度，取200 μL涂布于分离培养基，置37℃培养24 h，挑选能产生酶解圈的菌落，革兰氏染色，显微镜镜检初步认为是芽孢杆菌的，再进行纯化培养。

2.3 复筛

取纯化的菌液2 μL在分离培养基上滴种，置于37℃恒温培养24 h，观察并测量各菌株酶解圈和菌落直径，通过比较其比值大小，初步筛选出高产蛋白酶菌株。

2.4 蛋白酶活力测定

采用福林酚（Folin）法测定酶比活力，蛋白酶酶活力单位定义为在一定温度和pH条件下，1 min水解酪素产生酪氨酸1 μg为1个酶活力单位（U）。

2.5 菌株的生化试验

将上述筛选的菌株接种到微量发酵管，37℃恒温培养12 h，观察并记录试验结果，以标准枯草芽孢杆菌（Bacillus ATCC6633）为对照。

2.6 16S rDNA的鉴定

提取芽孢杆菌基因组，并以此为模板，反应体系为：10×PCR buffer 5 μL，MgCl22.5 μL，dNTP（10 mM）2 μL，上游引物（10 mM）2 μL，下游引物（10 mM）2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 38μL。反应参数：94 ℃，3 min→（94℃，50 sec→55℃，90 sec→72℃，90 sec，30 cycles）→72 ℃，10 min→4 ℃。取 5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳观察结果[4]。

2.7 序列分析

将上述PCR产物送至中美泰和生物技术（北京）有限公司测序，然后将所测序列提交到NCBI网站（美国国立生物技术中心网站）进行blast同源性分析。

3 试验结果

3.1 菌株初筛结果

通过菌株的菌落特征、显微特征和酶解圈的大小，初步分离得到86株产蛋白酶的菌株（部分菌株显微形态见图1～2）。

图1 部分菌株显微特征

图2 部分菌株显微特征

3.2 复筛

通过在分离培养基上滴种，比较酶解圈直径（H）与菌落直径（C）比值的大小，初步筛选出高产菌株，结果见附表和图3。

附表 蛋白酶产生菌的酶解圈结果

图3 部分菌株平板复筛选结果

3.3 菌株生理生化鉴定

结果表明，B.A464能氧化利用β-半乳糖苷、阿拉伯糖、甘露糖等，不能利用山梨糖、淀粉、葡萄糖酸盐等，根据形态特征观察及生理生化鉴定结果，参照伯杰氏细菌鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册该菌株基本符合蜡样芽孢杆菌的主要特征。因此初步鉴定B.A464为蜡样芽孢杆菌。

3.4 16S rDNA鉴定结果

3.4.1 PCR扩增结果

PCR扩增结果表明，该菌株的16S rDNA序列大小约为1 500 bp，与预期大小一致，结果见图4。

图4 PCR产物电泳结果

3.4.2 序列测定和序列进化树分析结果

经测序得16S rDNA序列长度为1 463 bp，与预期结果一致。将上述序列提交到美国国立生物信息中心（NCBI）进行Blast，结果见图5。

图5 B.A464序列进化树

由图5可知，菌株B.A464与蜡样芽孢杆菌Bacil⁃lus cereus亲缘关系最近，同源性比对结果表明，该株菌与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus 08001）的同源性为99%。

4 讨论

蛋白酶是一种作用于饲料中主要成分蛋白质的酶制剂，其在一定程度上可以帮助动物消化、降解饲料中的高分子蛋白质，对提高生产性能起很大作用，尤其是在幼龄动物上应用效果更为显著，已在仔猪、雏鸡等的生产实践中取得良好效果。

芽孢杆菌是一类产酶性能较强的微生物，而且一般芽孢杆菌又具有耐热、耐酸和耐胆盐的特性，很适合作为饲料添加剂。因此本研究通过采集大量样品进行筛选，并从中获得一株蛋白酶活性较高菌株B.A464，其酶活力可达2.19×103U·mL-1。李超敏等报道的嗜碱芽孢杆菌酶活力可达63.5 U·mL-1[1]。孙同毅等报道的产碱性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌HAP的酶活力高达1.22×104U·mL-1[2]。但这些菌株大都是碱性蛋白酶，且产量和酶学性质都不能满足畜牧业发展的需求。因此，相比较而言，本研究所分离菌株B.A464属于酶活性较高的菌株，很适合作为蛋白酶发酵生产的菌种和作为动物微生物饲料添加剂。而且本试验分离出的蛋白酶菌株B.A464是一种中性产蛋白酶菌株，虽然酶活力并不是目前报道最高的，但是因其同时具备了作为益生菌的多种性能，所以是一株很有应用潜力的菌株。下一步将对其作进一步诱变以提高其酶活力，同时对该菌的产酶条件和酶学性质做深入研究，为其临床应用奠定基础。

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