柚皮膳食纤维对去势雌性大鼠肠道发酵的影响

彭 林，桂 余，任文瑾，唐 艳，刘 雄

(重庆西南大学食品科学学院，重庆北碚400715)

柚(Citrus maxima)是芸香科植物柚的成熟果实，产于我国福建、江西、广东、广西等南方地区。柚子清香、凉润，营养丰富，药用价值很高，是医学界公认的最具食疗效益的水果。柚皮是柚子加工的副产品，不仅具有化痰，消食，下气等药用价值，还含有丰富的膳食纤维、微量元素以及多种生理活性成分，是一种潜在的、优良的膳食纤维资源［1］。对其进行研究应用，既可大量获得高纯度膳食纤维，又可解决柚皮堆砌腐败造成的环境污染问题。

膳食纤维(dietary fiber，DF)是指能抗人体小肠消化吸收而能在大肠部分或全部发酵的可食用的植物性成分、碳水化合物及其相类似物质的总称。按其溶解性特性，可分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和不可溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)两大类。大量研究表明，DF具有防治便秘［2］，降低血压［3］，预防冠心病［4－5］，改善糖尿病症状［6］等多种生理功能。此外，DF在预防人体胃肠道疾病和维护胃肠道健康方面具有突出的功能作用。DF在肠道内易被肠道细菌酵解，产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸(SCFA)，不仅影响肝脏中糖、脂代谢，还能够降低肠道内环境的 pH［7－9］。通常，肠道健康的改善与降低肠道pH、增加SCFAs产量、降低肠道中氨浓度、减少肠道中次级胆汁酸的分泌和改善细菌活性等方面相关［10］。柚皮中含有丰富的膳食纤维，而从柚皮中提取的可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维能否改善肠道健康还有待研究。本文主要通过对雌性大鼠进行双侧卵巢切除手术，模拟建立更年期模型实验，研究探讨了饲料中添加柚皮原料以及柚皮中提取的可溶性膳食纤维、不溶性膳食纤维对去势雌性大鼠体重、盲肠及其内容物pH、SCFAs、游离氨的影响。

表1 大鼠实验分组Table 1 Experimental group of rats

表2 实验饲料组成(g/kg)Table 2 Composition of experimental diets(g/kg)

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雌性SD大鼠 购自重庆滕鑫比尔实验动物销售有限公司;柚皮(梁平柚柚皮) 本地市场收集;柚皮可溶性膳食纤维和柚皮不溶性膳食纤维 实验室自提(基本成分见表3);L－胱氨酸(生化试剂)、氯化胆碱、氯化钠、苯酚、氯化铵、氢氧化钠(以上均为分析纯) 购自成都市科龙化工试剂厂;酪蛋白(食品级)购自华羚集团公司;玉米淀粉(食品级)购自西安国维淀粉有限责任公司;盐酸、硫酸(优级纯)购自成都市科龙化工试剂厂;巴豆酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸(以上均为色谱纯)购自梯希爱上海化成工业发展有限公司。

GC－2010高效气相色谱仪 日本岛津公司;WH－1微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂;PHS－3C型精密酸度计 上海大普仪器有限公司;Spectrumlab 22可见光分光光度计 上海棱光技术有限公司;JA2003A型电子天平 上海精天电子仪器有限公司;DHG－9070电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;5810型台式离心机 德国Eppendorf公司;SIGMA低温离心机 德国SIGMA公司;HH－B11电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;ES－315高压蒸汽灭菌锅 KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC。

1.2 实验方法

1.2.1 更年期综合症大鼠模型的建立 将体重为120～150g的4周龄SD雌性大鼠40只，每只单笼饲养在不锈钢大鼠笼中，室温(25±1)℃，12h明暗轮换(9:00～21:00)。以基础饲料喂食1周，适应喂养环境后，按大鼠体重随机分为5组(分组情况见表1)，腹部注射戊巴比妥钠(无菌生理盐水配制0.3%溶液，注射量1mL/100g大鼠体重)使其麻醉，任选一组进行伪切除手术(Sham)，其余4组进行双侧卵巢切除手术(OVX)。手术后基础饲料进行1周的恢复。

1.2.2 大鼠饲养与样品采集 恢复一周后，将OVX大鼠按体重随机分为4组，分别为空白组(OVXCN)、柚皮可溶性膳食纤维组(PPSDF)、柚皮不溶性膳食纤维组(PPIDF)、柚皮原料组(PP)(饲料配方见表2)。伪切除手术大鼠采食基础饲料(Sham－CN)，所有大鼠自由采食和饮水，每天记录大鼠采食量，实验周期为4周。实验期最后4天收集大鼠粪便，真空冷冻干燥后称重，贮存在干燥器中。实验期最后一天断粮12h，19:00～21:00乙醚麻醉后断头处死大鼠，剖腹取出小肠，用冰冻生理盐水冲洗出小肠内容物，收集在试管中，真空冷冻干燥后称重。取出大鼠盲肠连同内容物一起称重，将盲肠组织纵向剪开，收集盲肠内容物，－80℃冷冻备用;将刮出内容物后的盲肠壁用生理盐水洗净，用吸水纸吸干水分后称重，用铝箔纸包好4℃冷藏备用。

1.2.3 盲肠内容物含水率测定 称取一定质量的盲肠内容物，放入已恒重的铝盒中，烘箱105℃恒重，测定其含水率。

表3 基本化学成分(%)Table 3 Basic chemical component(%)

式中:m1:盲肠内容物湿重，g;m:盲肠内容物干重，g

1.2.4 盲肠壁表面积测定［11］用生理盐水洗净盲肠壁，用吸水纸吸干水分，充分展开后固定在划有标准刻度线(cm)的白色塑料板上，用数码相机拍摄展开的盲肠，将盲肠照片用打印纸打印，然后将纸上的盲肠轮廓图剪下，测出照片上的1厘米刻度线的长度(L，cm)，用精度为0.0001g的电子称精确称量轮廓图纸重量(W1，g)和平方厘米的纸重量(W2，g)，然后按以下公式计算出盲肠表面积:

1.2.5 盲肠内容物pH测定 称取0.2g左右的盲肠内容物置于去离子水预处理过的10mL离心管中，加入10倍重量的去离子水，旋涡混合仪上混匀后，离心机4000r/min离心10min，静置，测上清液pH。

1.2.6 盲肠内容物游离氨测定［12］称取0.2g左右盲肠内容物于10mL离心管中，加入10倍重量的无氨水，充分混匀后在4000r/min下离心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL含有0.001mol/L亚硝基铁氰化钠的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸钠的0.625mol/L氢氧化钠溶液，60℃保温5min，625nm波长下测吸光度。

1.2.7 盲肠内容物SCFA测定［12］称取约0.2g盲肠内容物放入超纯水处理过的10mL离心管中，立即加入2mL含有5mmol/L巴豆酸的10mmol/L NaOH溶液，旋涡混合仪上充分混匀后，静置1h，在4000r/min下离心15min;吸取上清液，继续在10000r/min下离心15min;吸取上清液 0.6mL，加入 0.6mL氯仿，4000r/min下离心15min;用1mL注射器吸取上清液，0.22μm滤膜过滤至2mL进样瓶待测。

色谱条件:进样量:1μL;进样口温度:220℃;柱流量:0.95mL/min，柱箱温度90℃、平衡时间0.5min，5℃/min升温至150℃，保留时间7min;检测器温度230℃;氢气流量40mL/min，空气流量400mL/min，尾吹流量40mL/min。

1.2.8 盲肠内容物中微生物的测定 取一定质量m1(0.150～0.350)的冻结盲肠内容物，加入9倍重量/体积的无菌生理盐水，涡旋混匀，得到10－1稀释度，依次稀释至10－7，通过预实验，每种菌选择合适的三个稀释度进行接种，接种量为200μL，用于大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的培养计数。大肠杆菌培养选用EMB培养基，肠球菌选用肠球菌琼脂(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂)培养基，37℃下恒温培养箱中培养48h计数。双歧杆菌和乳酸杆菌分别选用TPY琼脂培养基和乳酸杆菌选择性琼脂培养基，37℃下二氧化碳细胞培养箱中厌氧培养72h计数。结果以lg cfu/g表示。

1.3 统计分析

实验结果以mean±SD表示，各组间显著性差异采用SPSS分析，p＜0.05被认为有显著差异。

2 结果与分析

2.1 基本化学组成分析

柚皮原料、柚皮可溶性膳食纤维和柚皮不溶性膳食纤维基本化学组成分析见表3。

由表3可知，柚皮原料主要由不可溶性膳食纤维素、果胶、淀粉、蛋白质、灰分和少量脂肪等组成。而所提取的柚皮可溶性膳食纤维中果胶纯度达到84.3%，此外，所提取的柚皮不溶性膳食纤维纯度达到87.7%，仅残留了少量的蛋白质、脂肪和灰分。

2.2 柚皮膳食纤维对OVX大鼠体重、采食量、饲料效率的影响

从表4可以看出，伪切除组与空白组相比较，空白组的体重增加量、采食量和饲料效率均有升高的趋势，其中体重增加量达到极显著(p＜0.01)水平，饲料效率达到显著(p＜0.05)水平;与空白组相比，柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组OVX大鼠的体重增加量和饲料效率均有下降的趋势，其中可溶性膳食纤维组达到显著(p＜0.05)水平;各组采食量没有明显的变化。

柚皮可溶性膳食纤维和柚皮不溶性膳食纤维能够降低OVX大鼠体重和饲料效率，且柚皮可溶性膳食纤维下降达到显著(p＜0.05)水平。可见，柚皮膳食纤维，特别是柚皮可溶性膳食纤维能够抑制OVX大鼠的体重增长，达到防止肥胖的目的。

2.3 柚皮膳食纤维对OVX大鼠小肠内容物、粪便重量以及盲肠表面积、重量的影响

从表5可以看出，与空白组相比，伪切除组大鼠小肠内容物、粪便重量以及盲肠表面积、重量均没有明显变化;柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组的小肠内容物重均有升高的趋势，但没有达到显著水平。此外，相较于空白组，柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组的粪便干重、盲肠壁湿重以及盲肠表面积均有显著(p＜0.05)升高的趋势。

在饲料中添加柚皮可溶性膳食纤维、柚皮不溶性膳食纤维和柚皮原料均能增加OVX大鼠的粪便干重、盲肠壁湿重以及盲肠表面积。可见，柚皮膳食纤维不仅能够增加粪便体积，促进排便，还能帮助盲肠组织的代谢和更新、保护其形态和功能，起到调节肠道功能的作用。

表4 柚皮膳食纤维对OVX大鼠体重、采食量、饲料效率的影响Table 4 Effect of dietary fibre from pomelo peel on body weight gain，feed intake and feed conversion efficiency in ovariectomized rats

表5 柚皮膳食纤维对OVX大鼠小肠内容物、粪便重量及盲肠表面积、重量的影响Table 5 Effect of dietary fibre from pomelo peel on the weight of small intestine contents and feces，the weight and area of cecal tissue in ovariectomized rats

表6 柚皮膳食纤维对OVX大鼠盲肠内容物的影响Table 6 Effect of dietary fibre from pomelo peel on cecal contents in ovariectomized rats

表7 柚皮膳食纤维对OVX大鼠盲肠内容物中游离氨的影响Table 7 Effect of dietary fibre from pomelo peel on cecal contents FA in ovariectomized rats

2.4 柚皮膳食纤维对OVX大鼠盲肠内容物的影响

从表6可以看出，伪切除组与空白组相比较，空白组的盲肠内容物pH有显著(p＜0.05)升高的趋势，而含水率有下降的趋势;可见，雌性大鼠切除卵巢后会引起大鼠肠道环境发生改变，影响肠道健康。相较于空白组，柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组OVX大鼠的盲肠内容物重量均有显著(p＜0.05)升高的趋势。此外，与空白组相比，柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组OVX大鼠盲肠内容物的含水率均有上升的趋势，而pH均有下降的趋势，其中柚皮可溶性膳食纤维组和柚皮不溶性膳食纤维组pH下降达到显著(p＜0.05)水平。可见，柚皮膳食纤维具有较强的吸水力和溶胀性，不仅能够增加盲肠内容物的重量和含水率，防治便秘;还能降低盲肠内容物pH，从而改善肠道环境。

2.5 柚皮膳食纤维对OVX大鼠盲肠内容物中游离氨的影响

从表7可以看出，与OVX空白组相比，伪切除组大鼠盲肠内容物游离氨浓度有下降的趋势;柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组OVX大鼠盲肠内容物中游离氨的浓度相较于空白组均有下降的趋势，其中柚皮可溶性膳食纤维组和柚皮不溶性膳食纤维组达到显著(p＜0.05)水平。由此可见，在饲料中添加柚皮可溶性膳食纤维、柚皮不溶性膳食纤维和柚皮原料均能降低OVX大鼠盲肠内容物中游离氨浓度，从而改善肠道发酵环境。

2.6 柚皮膳食纤维对OVX大鼠盲肠内容物SCFA的影响

从表8可以看出，与OVX空白组相比，伪切除组大鼠盲肠内容物SCFA浓度没有明显变化，此外，相较于OVX空白组，柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组OVX大鼠盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸浓度和总SCFAs浓度均具有显著(p＜0.05)升高的趋势，柚皮不溶性膳食纤维组的增加趋势最为明显，异丁酸浓度没有明显变化。

表8 柚皮膳食纤维对OVX大鼠盲肠内容物SCFA的影响Table 8 Effect of dietary fibre from pomelo peel on cecal contents SCFAs in ovariectomized rats

表9 柚皮膳食纤维对OVX大鼠盲肠内容物微生物的影响Table 9 Effect of dietary fibre from pomelo peel on cecal contents microbe in ovariectomized rats

短链脂肪酸能够维持结肠粘膜上皮细胞的代谢和更新、保护结肠上皮的形态和功能、改善肠道健康。可见，饲料中添加柚皮可溶性膳食纤维、柚皮不溶性膳食纤维和柚皮原料均能显著(p＜0.05)增加OVX大鼠盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸以及总短链脂肪酸浓度，从而改善肠道健康。

2.7 柚皮膳食纤维对OVX大鼠盲肠内容物中微生物的影响

从表9可以看出，与OVX空白组相比，伪切除组大鼠盲肠内容物中双歧杆菌、大肠杆菌和肠球菌的数量均有显著增加的趋势;柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组OVX大鼠盲肠内容物中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量均有显著(p＜0.05)增加的趋势;而大肠杆菌和肠球菌的数量均有显著(p＜0.05)下降的趋势。

结果表明，在饲料中添加柚皮可溶性膳食纤维和柚皮不溶性膳食纤维会使OVX大鼠盲肠内容物中的有益微生物双歧杆菌和乳酸杆菌的数量增加，而使有害微生物大肠杆菌和肠球菌的数量减少。可见，柚皮可溶性膳食纤维和柚皮不溶性膳食纤维能够影响OVX大鼠肠道内微生物的生长，使大鼠肠道环境得到改善。

3 结论

膳食纤维在预防人体胃肠道疾病和维护胃肠道健康方面具有突出的功能作用。Takahashi H等［13］研究发现，水溶性膳食纤维可通过增加粪便含水率、粪便中乳杆菌含量以及增加排便频率等多方面改善便秘症状。不溶性膳食纤维具有较强的吸水力和溶胀性，能够增加粪便的体积和柔软度，增大粪便对肠壁的压力，刺激肠道收缩，加快肠道积物的排出速度，防止便秘的发生［14］。本研究结果中，饲料中添加柚皮可溶性膳食纤维、柚皮不溶性膳食纤维和柚皮原料均能够显著(p＜0.05)增加去势雌性大鼠的盲肠内容物重量和粪便干重，促进排便。此外，有研究表明，膳食纤维可在人体结肠肠道菌群作用下发生酵解，产生多种终产物，如甲烷、氢、二氧化碳和SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸等)［15－16］，SCFAs 是结肠粘膜上皮重要的能量物质［17－18］，具有维持结肠粘膜上皮细胞的代谢和更新、保护结肠上皮的形态和功能、调节肠道的功能。本研究结果表明，饲料中添加柚皮可溶性膳食纤维、柚皮不溶性膳食纤维和柚皮原料均能明显增加去势雌性大鼠的盲肠壁湿重、盲肠组织面积以及短链脂肪酸含量。

人体肠道中存在大量菌群，既生活着有益菌群，也生活着有害菌群。膳食纤维易被肠内有益菌完全或部分酵解，产生大量短链脂肪酸。SCFAs可调节肠道pH，改善有益菌的繁殖环境，使双歧杆菌、乳酸菌等有益菌增殖。这对抑制腐生菌生长、防止肠道黏膜萎缩、维持维生素代谢、保护肝脏等都是十分重要的［19］。有益微生物大量繁殖，利用发酵底物中的氮源，从而使盲肠内容物中游离氨浓度降低。本研究结果表明，与OVX空白组相比，柚皮可溶性膳食纤维组、柚皮不溶性膳食纤维组和柚皮原料组OVX大鼠盲肠内容物中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量均有显著(p＜0.05)增加的趋势;而大肠杆菌和肠球菌的数量均有显著(p＜0.05)下降的趋势。此外，饲料中添加柚皮可溶性膳食纤维、柚皮不溶性膳食纤维和柚皮原料还能够显著降低盲肠内容物的pH和游离氨的含量。

综上所述，饲料中添加柚皮可溶性膳食纤维、柚皮不溶性膳食纤维和柚皮原料均能明显促进去势雌性大鼠肠道的发酵作用，不仅显著(p＜0.05)增加去势雌性大鼠的盲肠壁湿重、盲肠面积、盲肠内容物重量以及短链脂肪酸含量，还能增加肠道内有益菌的数量并抑制有害菌生长，并降低盲肠内容物pH和游离氨的含量，从而改善肠道环境。

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