柴油降解新菌株的筛选及降解条件的研究

Mrie Thérèse Bidj Aben，谢观莲，钟卫鸿

(浙江工业大学a.生物与环境工程学院;b.国际学院，杭州 310032)

石油是目前环境中广泛存在的污染物之一，包括汽油、煤油、柴油、润滑油、石蜡和沥青等，由多种烃类(正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃)和少量其他有机物组成。随着经济的发展，人类对能源的需求不断扩大，石油已成为人类最主要的能源之一。随着石油产量和需求的不断提高，冶炼、储存、运输等环节泄漏所造成的水体、土壤和大气等环境污染更加突出。石油进入土壤后与土粒粘连，土壤结构被破坏，降低土壤的透气性和渗水性［1］。目前，国内外石油污染土壤修复技术按其性质可分为3种:物理方法、化学方法和生物方法。石油污染的生物修复，是指利用处理系统中生物(主要是微生物)的代谢活动来减少污染现场污染物的浓度或使其无害化的过程，其最终产物是CO2、H2O等物质［2］。与物理、化学修复技术相比，具有多种优点［3］:成本低;对人和环境造成的影响小;污染物氧化完全。微生物的生物降解效果受许多因素的影响，如温度，pH值，营养物，氧，培养基组成，污染物的浓度和生物利用度［4］。关于石油类降解微生物已有一些报道，但符合实际应用要求的菌株还有待不断地开发和研究。为研究适合非洲本土环境的石油类降解微生物，研究从来自喀麦隆未受柴油污染土壤中，筛选分离出高效柴油降解酵母，分析了影响其降解能力的几种因素，为进一步应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的来源

降解柴油的菌株从来自喀麦隆的土壤中分离得到。

1.1.2 培养基的配制

无机盐培养基(MSM)［5］:NH4Cl 1g，K2HP041g，Na2SO42g，MgS04·7H20 1g，CaCl2·6H2O 0.01g，蒸馏水 1L，pH=6.0，121℃高压蒸汽灭菌 20min。

无机盐含柴油固体培养基:无机盐培养基，琼脂15～20 g，柴油 1 mL。

查氏固体培养基(Czapek agar medium):K2HPO41 g;KCl0.5g，蔗糖 30g，FeSO40.01g;MgSO40.5g，NaNO32g，蒸馏水1L，pH 6.8，琼脂15 ～20g，121℃高压蒸汽灭菌20min。

1.1.3 仪器

UV-1000紫外分光光度计;双层全温恒温培养摇床;Agilent Technologies 6890-5975气相色谱—质谱法联用仪等。

1.2 方法

1.2.1 柴油降解菌株的筛选与鉴定

柴油降解菌株的筛选:吸取1 mL土壤悬液涂布于查氏固体培养基，30℃倒置培养72 h。在培养后，为进一步利用将菌株在40%甘油-20℃保存。将甘油保藏菌重新转接到以柴油为唯一碳源的无机培养基中，30℃，180rpm摇床培养5d，待培养基变混浊后，用无机盐含柴油固体培养基培养，将纯化菌株于试管斜面培养后4℃保藏。

柴油降解菌株的鉴定:对分离得到的柴油降解菌株应用5.8SrDNA-ITS序列分析进行酵母的分子鉴定，结合传统的鉴定方法，根据微生物的形态特征和生理生化特征，参照《酵母菌的特征与鉴定手册》［6］及相关文献，最终将菌株鉴定到属。酵母总DNA提取，用Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取酵母的DNA。用PCR扩增仪进行扩增反应，体系总体积为50μL。采用通用引物(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)［7］扩增供试菌株的 ITS1-5.8SrDNA-ITS片段，送至上海英俊生物技术公司测序。将测序结果进行BLAST比对分析并用软件MEGA5.0构建系统进化树。

1.2.2 柴油降解率的测定

将柴油配成0.1 mg/mL的标准溶液，分别移取0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL 溶液于10 mL 容量瓶中，用正己烷稀释定容。分别倒入石英比色皿中，以正己烷作空白对照在紫外分光光度计中在254nm波长下测定，得到标准曲线。将试验中的萃取液在10 000r/min，4℃下高速冷冻10min。稀释定容后测定萃取吸光度。根据回归计算得标准曲线方程:y=4.820x-0.001(R2=0.999)，其中 y 表示吸光度，x表示柴油质量浓度，R2表示相关系数。

柴油降解率的计算:柴油的降解率=(初始柴油浓度-残余柴油浓度)/初始柴油浓度×100%

1.2.3 影响柴油降解因素的研究

在装有50mL无机盐培养基的250mL三角瓶加入1mL柴油，2mL种子液(4.6×108cells/mL)。测定不同的温度(20℃、30℃、和37℃)、pH 值(分别为6、7、8、9 和10)、不同的氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素和NH4Cl，浓度均为1 g/L)，以及添加不同浓度的鼠李糖脂 (10 g/L、20 g/L和60g/L)对柴油降解的影响，同时设置了空白试验，即除不加菌株外其余条件保持一致，在180r/min恒温摇床连续培养9d，检测柴油降解并确定优化降解条件。

1.2.4 气相色谱—质谱法联用仪设置

分别提取培养0d，5d，9d后的残油1ul，按照之前描述过的方法进行GC/MS分析［8］。载气为He，载气总流量为1 mL/min;进样模式为分流;进样口温度:250℃;检测器接口温度:250℃;柱箱温度:60℃，保持2min，以20℃/min升至300℃，保持5min;电离方式:EI;电离能:70eV;扫描模式:全扫描;扫描质量范围:41～500amu。

2 结果与分析

2.1 柴油降解菌株的鉴定

分别采用常规的土壤稀释法和平板涂布法从来自喀麦隆地区的土壤中分离出一高效柴油降解菌株，在含柴油平板和摇瓶中都能很好地生长。将菌接入液体柴油无机盐培养基摇床培养2d后，培养基开始逐渐变成乳白色，浮在液面上的柴油逐渐减少。通过稀释涂平板，最终得到一株能利用石油烃的酵母菌，命名为KML。将筛选出的进行菌体形态特征，菌落圆形，乳白色，大小为1.7-4.2×2.3-7.7μm。菌株的生理生化试验结果见表1。

表1 柴油降解菌株的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain KML

对该菌株DNA进行PCR扩增，以酵母5.8S rDNAITS通用引物，扩增到358bp的DNA片段，GenBank登录号为JX420122。通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株于解脂耶罗维亚酵母的序列同源性最高。选出9种同源性较高的序列，利用MEGA5.0的邻近法构建系统发育树。结果如图1所示，该菌株与Yarrowia lipolytica Y25(EU603297)位于同一个系统发育的分支。

图1 基于5.8SrDNA－ITS构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of strain KML based on the 5.8SrDNA －ITSgene sequence

2.2 降解影响因素的研究

2.2.1 初始pH对降解率的影响

由图2(A)可知，菌株对pH值有较广泛的适应范围，pH从6～10均具有比较好的适应性。但在pH为9时降解率最高，达到75.1%。一般适合酵母生长的pH环境是偏酸的，在有的研究中，pH 6.0时柴油降解率最大［9］。而在吴兰等人的研究中，游离解脂耶罗维亚酵母在初始pH 6～10范围内对色拉油都有着较好的降解效果，降解率维持在60%以上，表明解脂耶罗维亚酵母能很好地适应中性偏碱的环境［10］。

2.2.2 温度对降解率的影响

由图2(B)可以看出，该菌株KML对柴油降解的适宜温度在20℃ ～37℃范围内，温度在30℃降解率最高达到59.0%，在37℃时降解率最低，只有41.0%。温度对降解率的影响主要表现在两方面:一是影响石油烃降解菌的生长速度;二是影响油的物理状态和化学组成［11］。低温时，由于某些对微生物有毒害的低分子量石油烃类在低温下难挥发，石油黏度升高，会对石油烃类的降解有一定的抑制作用，同时酶活力也降低，所以低温下石油烃类较难降解［12］。随着温度的上升，烃的代谢增加，高温引起的烃化合物膜毒性增加，使得温度对生物的新陈代谢过程起了相反的作用，抑制了石油烃类的微生物降解。

2.2.3 不同的氮源对降解率的影响

由图3(A)可知，添加酵母膏后降解效果最佳，降解率接近77%。微生物的生长繁殖需要碳、氢、氧、磷和其他各种矿物质元素［13］。石油污染物含有大量的碳和氢，是微生物可以利用的底物，但它只能够提供有机碳而不能提供其他营养物。因此，氮源和磷源是常见的烃类生物降解限制因素，添加适量营养物可以促进生物降解。

2.2.4 不同的鼠李糖脂浓度对降解率的影响

图2 初始pH和温度对降解率的影响Fig.2 Effects of initial pH(A)and temperature(B)on the percentage of diesel oil degraded

图3 氮源和鼠李糖脂对降解率的影响Fig.3 Effects of nitrogen sources(A)and rhamnolipid(B)on the percentage of diesel oil

从图3(B)可以看到，在添鼠李糖脂浓度10mg/mL时降解率达到最高，为78.0%。但随着浓度的增大，降解率有所下降，这表明表面活性剂对细胞有一定的毒害作用。少量的表面活性剂会促进柴油的降解。因为加入表面活性剂可以为菌体提供一个既亲水又亲油的界面，一方面使柴油易于和菌体接触，另一方面能降低油—水界面张力，使柴油变为细小油滴，对汽油产生显著的协同增溶作用，构成乳液，增加柴油的生物可利用性，使扩散进入菌体细胞，加速汽油的降解［14］。

2.2.5 GC －MS 分析结果

图4表示对降解后(第5d和第9d后)剩下的柴油进行了分析，探求生物降解后石油烃组分的变化。如图分别是培养前后(5d和9d后)培养基中柴油的GC－MS图谱。经过5d和9d后，柴油链烃含量有所下降，主要降解了C9～C25的直链烃和少量支链烃，最后只剩下了一些不饱和烃。

图4 柴油组分气相色谱—质谱图Fig.4 GC －MSanalysis of diesel components

3 结论

本研究在以柴油为唯一碳源的选择性培养基中筛选出柴油降解菌株KML，经鉴定，该菌株为解脂耶罗维亚酵母。对其培养条件进一步考察，在温度为30℃、pH为9、添加酵母膏(1g/L)和鼠李糖脂浓度(10g/L)的条件下，降解率可提高到78%。通过GC－MS组分分析，该菌主要降解C9～C25的长链烃和少量支链烃。由此可知，KML是株有应用潜力的柴油降解菌。

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