金针菇深层发酵糖量测定

党阿丽，陈立娟，王玉文，张恩波，杜世彧

(1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010;2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150001)

在金针菇深层发酵过程中，应对其发酵液进行糖量检查，以便有针对性地进行管理和控制。糖量化学分析测定方法有很多，如碘量法、3，5－二硝基水杨酸比色法、蒽酮比色法、斐林氏法等。其中，斐林氏法是生产实践中常用的快速定糖方法。为此，笔者根据自己的试验条件进行如下的糖量测定。

1 材料、仪器和试剂

(1)材料

测定样液:我们从20株中筛选出的一个适于液体培养的金针菇菌株之深层发酵液。

(2)仪器

适宜的吸管、容量瓶、烧杯、三角烧瓶、滴定管等玻璃仪器;电炉、天平、离心机等。

(3)试剂

硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氰化钾、葡萄糖、醋酸铅、硫酸钠等。

2 步骤和方法

2.1 试剂溶液的配制［1，2］

(1)斐林试剂:甲液，称取15g硫酸铜(CuSO4·5H2O)和0.05g次甲基蓝，用蒸馏水定容至1L。乙液，称取50g酒石酸钾钠、54g氢氧化钠和4g亚铁氰化钾，用蒸馏水定容至1L。

(2)0.1%标准葡萄糖溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖1.00g，先用少量蒸馏水使之溶解，加8mL浓盐酸以防微生物生长，再用蒸馏水定容至1L。

(3)10%醋酸铅溶液:称取10g醋酸铅溶于100mL蒸馏水中即可。

(4)6N盐酸:以等体积的蒸馏水稀释试剂盐酸。

(5)6N氢氧化钠溶液:250g氢氧化钠溶于1L蒸馏水中即可。

2.2 还原糖的测定

(1)样品处理

除蛋白:将适量的金针菇发酵液于2 500rpm离心10min，取其上清液25mL，加入2.5mL10%醋酸铅溶液，用蒸馏水定容至50mL，混匀。然后1 000rpm离心5min。

除剩余Pb2+:取上述除蛋白之上清液10mL于一小三角瓶内，加入0.5g硫酸钠，振摇，离心之。弃去沉淀，再用蒸馏水使其上清液补足10mL，待测定。

(2)样品测定

取经处理的样液及其它试剂按表1加入三角瓶中。

表1 样液和试剂加法及加量Tab.1 Reagents addition and addition dosage of the sample solution

按斐林氏热滴定装置测定［1］。

(3)计算

发酵液中还原糖含量的计算公式为:

Ve是样液3次平行测定所耗用糖液总毫升数的平均值。

在该测定中，上式可简化为:

2.3 总糖的测定

(1)样品处理

量取15mL混匀的发酵液于一小玻璃容器中，加入适量的6N盐酸，水浴加热30min，再用6N氢氧化钠中和酸，用蒸馏水稀释至60mL，离心之。取其上清液25mL，加入12.5mL10%醋酸铅溶液，其余操作与还原糖的测定相同。

(2)样品测定

与还原糖的测定相同。

(3)计算

在该测定中发酵液中总糖含量的计算公式为:

3 结果和讨论

3.1 试验测定结果见表2［3］

3.2 讨论

(1)本方法的关键是在保证试验操作各项条件一致性情况下的快速滴定，即在沸腾状态下3min之内将不到2.00mL的剩余糖液以4～5秒一滴的速度滴至终点。为此，应根据预测定试验在未滴定之前预先加入V体积糖液。否则，滴定速度过慢，一方面会使反应液蒸发过多而改变溶液浓度等条件;另一方面，在接近滴定终点时，由于还原型的次甲基蓝遇到空气后又能转为氧化型的次甲基蓝而导致滴定终点判断的错误，影响试验结果的准确性。

表2 金针菇菌丝体发酵液分析测定结果Tab.2 Analysis results of Flammulina velutipes in fermented mycelium liquid

(2)滴定终点的判断:肉眼观察到蓝色消失而出现黄色时即为滴定终点。

(3)通过对还原糖测定数据的分析，可知只要严格操作(包括各试剂的准确量取及其条件的一致)该法就有较高的精密度，这说明该法有很好的稳定性和重复性。但若要提高总糖测定的准确性，我们认为取样是很重要的，必须从混合均匀的发酵液中取出具有代表性的样液进行测定，结果才有意义。

(4)在测定之前，必须对样品进行处理，因为如果不除去发酵液中的蛋白质，则在沸腾时会产生泡沫而带起部分反应液，这样在一定程度上就会影响反应正常进行。剩余铅离子的存在也会影响滴定终点的判断，从而导致错误结果。

(5)按上述公式计算所得的糖含量实际上指的是发酵液经离心除去其中的沉积物后之上清液的糖含量，如果说这可达到测定目的及满足要求，则可将其视为发酵液的糖含量。但上清液的糖含量与发酵液的糖含量在数值和含意上是不同的，所以，从严格意义上讲，计算发酵液中糖的百分含量时应将式中吸取测定样品毫升数折算成相应的发酵液体积(毫升数)即可。

［1］朱俭.生物化学实验［M］.上海:上海科学技术出版社，1981:4－8.

［2］洪震，卯晓岚.食用药用菌实验技术及发酵生产［M］.北京:中国农业科技出版社，1992:233－236.

［3］杜世彧，党阿丽，王凤云.金针菇菌丝体的深层培养及多糖制取［J］.生物技术，1996，6(6):41 －44.