嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)TT03对碱性土壤的作用效果

郭立姝，于丽萍，殷 博，曹亚彬，吴皓琼，牛彦波，甄 涛，党阿丽

(黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010)

基于硫杆菌能够氧化硫生成硫酸的特性，其在工业生产中已经被广泛地应用，如湿法冶金、重金属回收、煤炭脱硫［1－6］等。在农业生产中，也有一些研究报道［7］，使用硫粉和一些富含磷钾的矿石粉与有机物料一起进行堆肥，利用自然存在的硫杆菌的作用，显著降低了堆肥物料的pH值，提高了堆肥中的有效磷、有效钾的含量，提高了堆肥的质量。张静、杨清等［8］研究了硫杆菌在不同类型盐碱土壤中的应用，研究结果表明了其对降低土壤pH有明显作用，处理的几种土壤其pH有不同程度的降低。赵晓进、李亚芳等［9］使用硫磺粉进行改良盐碱地的研究也是基于硫杆菌的作用，试验结果表明，使用硫粉处理种植棉花的土壤，降低了土壤的pH，改善了土壤的养分状况，促进了棉花植株的生长。吴曦、陈明昌等［10］使用硫磺处理种植油菜的碱性土壤，显著降低土壤的pH值，增加土壤有效磷含量。与对照相比，施硫磺后土壤pH值最大降幅为0.5个单位;当硫磺用量为120 mg/kg时土壤有效磷含量最高，比对照增加了68.6%。同时施用硫磺能增加油菜植株生物量，降低油菜植株体内硝酸盐含量，提高硝酸还原酶的活性和植株吸磷量，与对照相比，油菜植株生物量最大增加了29.64%，植株体内硝酸盐含量降低了58.6%，硝酸还原酶活性提高了近1.8倍，吸磷量增加了1.55倍。这些研究结果证明了硫杆菌在改良碱性土壤方面的应用效果和潜力，为此，笔者在前期研究的基础上［11］，针对自行分离选育的氧化硫硫杆菌TT03进行转化单质硫的研究，为实际应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料:嗜酸性氧化硫硫杆菌TT03(Acidithiobacillus thiooxidans)为研制单位自行分离鉴定。碱斑土壤取自肇东市西4公里的公路收费站附近;碱性耕作土壤取自肇东市宋站镇附近农田。

表1 TT03对碱斑土壤影响的试验方案Tab.1 The test scheme on effect of TT03 on highly alkaline soil

1.1.2 培养基:史塔克培养基［13］组成:2g(NH4)2SO4、3gKH2PO4、0.01gFeSO4·7H2O、0.5gMgSO4·7H2O、0.25 gCaCl2、10gS、水 1 000mL、pH4.0;制备:除硫粉外，其他成分溶解水中，在0.8kgf/cm2下灭菌30min;硫磺粉隔水常压灭菌，使用前加入培养基中。固体史塔克培养基补加20g水洗琼脂，以10gNa2S2O3替代硫磺粉，过滤方式除菌，使用前加入培养基中。

表2 TT03对碱性耕作土壤影响的试验方案Tab.2 The test scheme on effects of TT03 on alkaline soil

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备:在史塔克液体培养基中培养的TT03菌液，在低温高速离心机中离心，收集菌体，再以无菌生理盐水洗涤1～2次至pH到中性为止，再用无菌生理盐水稀释至原体积，4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 氧化硫硫杆菌TT03对碱斑土壤作用的试验方法:土壤风干细化后与硫粉混合均匀，再加入菌液及水，使土壤潮湿而不渗水为止，待处理的土样分别装入小花盆中，每盆500g。至培养室中培养，白天升温至25℃以上，夜间自然温度，过程中定期补充水以保持土壤湿润。具体的处理方法见表1。

图1 TT03及硫粉处理碱斑土壤的pH变化过程Fig.1 The change of pH in alkaline soil after processed by TT03 and the sulfur

1.2.3 氧化硫硫杆菌TT03对碱性耕作土壤作用的试验方法:称取5kg的碱性耕作土壤，其原始pH为8.27，加入单质硫粉0.5g，液体菌剂15mL，混合均匀后，平铺到带孔塑料板上，土层厚度为30cm，均匀喷水，在保湿培养箱放置，室温在28℃，处理期间视水分情况补充水分，以保证土壤的潮湿状态(水分控制在15% ～25%)。在此条件下处理，定期取样测定。试验以不加菌剂为对照处理。

1.2.4 采用酸碱滴定法测定酸度，以硫酸含量表示;采用沉淀法测定硫酸根含量;采用碱解扩散法测定碱解氮;采用碳酸氢钠法测定速效磷;采用醋酸铵浸提法测定速效钾;pH采用电位仪法测定;重碳酸盐采用双指示剂滴定法测定［12－13］。固氮作用强度、硝化作用强度、氨化作用强度、磷转化强度、酚降解强度、土壤呼吸强度的测定参考“土壤酶及其研究法”［14］进行。

1.2.5 计算方法:液体中单质硫粉的转化率以实际培养TT03后产生的硫酸量与加入单质硫粉按理论被完全转化产生的硫酸量的百分比表示。土壤中单质硫粉的转化率以实际培养TT03后产生的硫酸根含量与加入单质硫粉按理论被完全转化产生的硫酸根的百分比表示。

表3 TT03与硫粉处理后碱斑土壤的主要成分含量变化 mg/gTab.3 The change of primary nutrient in highly alkaline soil after processed by sulfur and TT03

2 结果

2.1 TT03及硫粉对碱斑土壤的作用

利用TT03及硫粉处理碱斑土壤过程中，空白处理(对照2)与菌悬液处理(对照1)的pH变化不明显，代表了土壤的自然状态。外源的菌悬液与硫粉进入土壤后，土壤的性状发生改变。随菌悬液与硫粉用量的提高，pH的下降幅度与速度皆有显著的提高(图1)，以处理3的效果最为明显，处理结束时pH由初始的10.03下降到8.78，pH下降幅度为1.25。除了pH的变化以外，碱斑土壤的内部性状也发生改变，重碳酸盐有较大幅度的下降，硫酸根含量猛增，速效磷含量显著增加(表3)。综合表中的结果，可以判定硫酸根上升、重碳酸盐下降与速效磷增加三者之间是紧密相关的。TT03及硫粉处理碱斑土壤也引起土壤微生物活动的变化(表4)，除固氮强度没有明显的变化以外，其他的生化指标皆向着有利于农作物生长的方向改变，体现出了TT03及硫粉处理碱斑土壤的效果。

表4 TT03与硫粉处理后碱斑土壤的生化指标变化Tab.4 The change of biochemical function in highly alkaline soil after processed by sulfur and TT03

2.2 TT03对碱性耕作土壤的作用

以碱性耕作土壤、硫粉、TT03菌液及水组成基本培养物料(表2)，在相同的条件下培养，其试验的结果列于图2中。在试验期内，对照1的硫酸根含量微有上升，基本与未处理前相同;对照2的硫酸根含量逐渐而缓慢的升高，培养到第63d时pH下降到8.11，硫酸根含量由原始样品的18.2mg/kg上升到64.6mg/kg，提高了3.55 倍，表明即使在碱性土壤中，仍然有土著的硫杆菌存在;处理样品的硫酸根含量在7d后开始迅猛增长，28d时pH为7.94，硫酸根含量达到187.4mg/kg，单质硫转化率达56.4%，随后增长趋于缓慢，在培养至63d时，pH为7.73，硫酸根含量上升到232.3mg/kg，是初始含量的12.76倍，单质硫转化率达71.4%。在同等条件下，添加TT03菌剂处理相比于不添加TT03菌剂的对照2，在培养到63d时，转化单质硫生成硫酸根的量提高了3.59倍，试验结果表明外源添加氧化硫硫杆菌对碱性土壤中单质硫转化有显著促进作用。

图2 TT03在碱性土壤中对硫的转化Fig.2 The sulfur changed by TT03 in alkaline soil

碱性土壤中外源加入TT03菌剂与硫粉，经过一段时间的培养处理，生成的硫酸改变了土壤的性状(表5)。

表5 TT03与硫粉处理后碱性土壤营养成分的变化Tab.5 The change of primary nutrient in alkaline soil after processed by sulfur and TT03

首先土壤的pH明显下降，经过28d与63d的处理，pH分别下降到7.94与7.73;同时由于土壤pH下降，使得土壤中营养物质被更有效地溶出，土壤的速效养分明显提高，水解性氮由培养前的20.13 mg/kg分别提高到21.22 mg/kg与 22.65 mg/kg，分别增加到原值的 105.36% 与112.51%;速效磷由培养前的12.11 mg/kg分别提高到18.18 mg/kg、32.45 mg/kg，分 别 增 加 到 原 值 的 为150.12%、178.49%;速效钾由培养前的 79.6mg/kg 分别提高到132.45 mg/kg、178.24 mg/kg，分别增加到原值的166.39%、223.91%;相比较而言，有效磷、有效钾的增幅效果远高于水解氮，这是由于土壤中氮磷钾的存在形式不同及硫酸对它们的溶出效果不同而造成的结果。由于单质硫被氧化成硫酸，土壤中硫酸根的含量大幅度上升，与完全空白对照与单施硫粉对照相比，处理28d时硫酸根含量分别提高4.5倍与9.9倍，处理63d时，硫酸根含量分别提高3.6倍与10.4倍;同时由于酸碱中和作用，土壤中的部分重碳酸盐被转化为二氧化碳而排放，其含量下降，在培养到28d与63d时，由初始的766.5 mg/kg分别下降到650.4 mg/kg与605.3 mg/kg(表6)。

表6 TT03与硫粉处理后碱性耕作土壤pH与硫酸根的变化Tab.6 The change of pH and sulfate ions in alkaline soil after processed by sulfur and TT03

3 讨论

氧化硫硫杆菌TT03对硫的氧化取于其生存的环境与硫的供给，在其能耐受的pH环境下，对硫的氧化能够持续进行。在碱性土壤中，环境土壤呈碱性，TT03仍能生长，可能是由于碱性土壤的总体环境与微环境之间的差异造成，在微观环境下，某些土壤颗粒的环境条件及外源加入的硫粉颗粒会满足TT03的生长要求，并且随TT03生长产酸，微观环境的改变会进一步有利于其生长。TT03对土壤速效营养的影响是明显的，速效磷、速效钾的大幅度提高是土壤向酸性变化的具体体现，酸性条件更有利于一些难溶性磷或钾化合物的溶解。研究对TT03用于碱性土壤改良仅进行了初步的探索，结果表明了TT03在此方面的效果与潜力，更多的问题将在今后的工作中深入研究。

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