猪生物发酵床保育期垫料中效应细菌的筛选及鉴定

广东恒兴饲料实业股份有限公司科研技术中心 朱双红 韩垂旺

华中农业大学动物遗传育种国家重点实验室 邓昌彦 郑 嵘＊

猪生物发酵床养猪技术是按照一定比例，将功能微生物（或EM菌剂）与垫料（木屑、锯末、米糠、谷壳等）等辅助材料及活化剂混合发酵，然后平铺于圈舍内，猪只饲养在发酵床上，其排泄的粪尿与垫料在猪只翻拱或人工翻耕下混合发酵，是一种集猪只饲养与粪尿处理同步进行的环保养猪技术 （陈玉红等，2010；Tam和 Vrijmoed，1993）。

生物发酵床养猪技术的实质是微生物的代谢和发酵作用。发酵床垫料中，除了土著微生物外，还人为添加了一些功能性微生物，它们在相互作用的过程中，群落结构和数量会发生很大变化，产生一些优势菌群。这些优势菌群在发酵床运行过程中可能发挥重要作用，因此，有必要对垫料中优势菌群的组成和作用进行研究，以期开发出安全、稳定、高效的微生物菌剂，促进生物发酵床养猪技术的进一步发展。

1 材料与方法

1.1 材料 试验用的猪生物发酵床保育期垫料取自湖北省桑梓湖种猪场。

1.1.1 培养基 基础培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；筛选效应细菌培养基为明胶液化培养基、油脂水解培养基、淀粉水解培养基、纤维素降解培养基。

1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），北京百泰克生物技术有限公司；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit（Axygep，USA）；dNTPs、Taq DNA polymerase、DNA marker DL2000，均为北京庄盟国际生物基因科技有限公司；pMD18-T vector，大连宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 取猪生物发酵床保育期垫料样品，4℃保存，3～5 d完成样品的预处理和分离，保存菌种。

1.2.2 细菌分离纯化 将样品做梯度稀释，无菌操作接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养24～72 h，结合镜检，并对数量优势的细菌纯培养，保存菌株备用。

1.2.3 效应细菌的筛选

1.2.3.1 淀粉水解试验 将待测菌株点种于淀粉水解培养基，37℃培养36 h，滴入几滴卢哥氏碘液，若菌落附近出现无色透明水解圈，说明淀粉被水解，透明圈越大，菌株水解淀粉的能力越强（凌云，2004）。菌株水解能力计算公式：

式中，Up为菌株水解能力；D为透明圈直径平均值，mm；d为菌落直径的平均值，mm。

1.2.3.2 明胶液化试验 将待测菌株穿刺接种于明胶液化培养基中，20℃分别培养 3 d后，取出，观察并记录明胶液化高度。

1.2.3.3 油脂水解试验 将待测菌株点种于油脂水解培养基，37℃培养60 h，观察培养基上是否出现红色斑点，若出现表明油脂被水解，为阳性，记为“+”，反之为阴性，记为“-”。

1.2.3.4 纤维素降解试验 将菌株接种于纤维素降解培养基，同时设空白对照，37℃培养30 d，每5 d观察1次。若滤纸条变薄、折断或分解为一团，表明菌株具有分解纤维素的能力，反之不能分解纤维素（Mandels和 Sternberg，1985）。

1.2.4 效应细菌属的鉴定 根据细菌菌落特征与个体形态、染色及生理生化反应进行鉴定，以确定菌株属别。具体方法有革兰氏染色、V.P试验、M.R试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、油脂水解试验、纤维素降解试验、H2S试验、吲哚试验、硝酸还原试验、氮源利用试验和碳源利用试验（东秀珠和蔡妙英，2001；程丽娟等，2000；布坎南，1984）。

1.2.5 效应细菌种的鉴定 效应细菌种的鉴定用16S rRNA基因序列分析法，即用细菌通用引物27 F和1492 R对效应细菌近全长16S rDNA片断PCR扩增。正向引物27 F序列为5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，反向引物1492 R序列为5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’（Dojka 等，1998）。 PCR 反应总体系为 50 μL： 4 μL 2 mmoL/L dNTPs，5 μL 10×PCR buffer（含 Mg2+），1U Taq DNA polymerase，1 μL 基因组DNA，正、反向引物各 1×10-5μmol，其余用 ddH2O补充。PCR反应参数：94℃预变性5 min，94℃变性 40 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，28个循环，最后72℃延伸10 min。扩增后，取1 μL上样缓冲液和5 μL PCR扩增产物，混合后点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，同时点5 μL DNA Marker DL 2000作为参照。120 V电泳30 min后，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察、拍照、存盘。然后将PCR产物回收纯化后克隆到载体pMD18-T vector上，挑取DH5α阳性克隆，委托北京奥克生物科技有限公司测序，将所得序列用软件DNAStar校对，并在NCBI网站上进行序列blast相似度分析。

2 结果与分析

2.1 细菌分离纯化 在稀释度为10-5时，细菌菌落长势较好，分布均匀且较为独立，共获得细菌30株，记为 B1～ B30。

2.2 效应细菌的筛选

2.2.1 淀粉水解试验 由图1可知，不同细菌菌株水解淀粉的能力不同，能够水解淀粉的细菌有9 株，其中 B6、B15、B29水解淀粉的能力较强（与平均值相比），其余菌株水解淀粉的能力较弱。

2.2.2 蛋白质水解试验 由图2可知，不同细菌菌株水解蛋白质的能力不同，能够水解蛋白质的细菌有 12 株， 其中B4、B6、B10、B12、B29水解蛋白质能力较强（与平均值相比），其余菌株水解蛋白质的能力较弱。

2.2.3 油脂水解试验 能够水解油脂的细菌菌株有12 株（B1、B4、B7、B8、B10、B12、B19、B21、B23、B24、B26、B27），占细菌总数的40%，其余菌株无水解油脂的能力。

2.2.4 纤维素降解试验 将待测菌株接种于纤维素降解培养基，每5 d观察1次，30 d后，只有B4、B6、B10、B12将滤纸变薄，说明纤维素被分解，其余菌株没有降解纤维素的能力。

上述结果表明，在分离菌株中，B4菌株降解蛋白质的能力较强在平均值以上，同时也具有分解油脂和纤维素的能力；B6降解蛋白质能力最强，降解淀粉的能力较强，同时也能降解纤维素；B10对蛋白质水解能力较强，对淀粉水解能力不强，在平均值以下，同时兼有降解油脂和纤维素能力；B12降解蛋白质的能力较强，兼有降解油脂和纤维素的能力；B15水解淀粉的能力最强，但是不具备降解蛋白质、油脂和纤维素的能力；B29水解淀粉和蛋白质的能力均较强。因此这6株细菌综合降解有机质的能力较强，在猪生物发酵床保育期垫料有机物的降解过程中可能发挥重要作用，是本研究筛选出的效应菌株。

2.3 效应细菌属的鉴定 根据菌落特征与个体形态、染色及生理生化鉴定结果（表1），最终确定效应细菌菌株 B4、B6、B10、B15为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），B12为沙雷菌属 （Serratia sp.），B29为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。

表1 效应细菌形态及生理生化鉴定结果

2.4 效应细菌种的鉴定

2.4.1 效应细菌基因组总DNA提取 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取效应细菌的基因组总DNA。结果表明，提取的DNA完整、无拖尾和杂带（图 3）。

2.4.2 效应细菌近全长16S rRNA扩增 用细菌通用引物27 F和1492 R扩增效应细菌16S rRNA基因片段，目标片段约为1500 bp。结果表明，扩增条带较亮，大小符合预期（图4）。

将目的条带回收、纯化、克隆和测序，最终得到效应细菌的16S rRNA序列。将所得基因序列用软件DNAStar校对后，提交到NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行 Blast比较，选择与GenBank中核苷酸序列相似度最高的菌株。结果发现，这些序列分别与已知的假单胞杆菌（Pseudomonas）、枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）和粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的基因序列有98%、99%、99%、99%、100%和100%的相似率。结合菌落特征与个体形态、染色及生理生化鉴定结果，可以确定 B4、B6、B10、B12、B15、B29分 别 为 枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis）、 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、 地 衣 芽 孢 杆 菌 （Bacillus licheniformis）、 粘 质 沙 雷 氏 菌 （Serratia marcescens）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和假单胞杆菌（Pseudomonas）。

3 讨论

微生物的种属鉴定是深入认识微生物的重要环节，然而传统的根据菌落特征与个体形态、染色及生理生化反应进行鉴定的方法，只能将微生物鉴定到属，极少数鉴定到种，加之，目前环境中可培养的微生物不足0.1%～1%，以及生理生化鉴定具有可变性，因此传统的鉴定方法有一定的局限性（Torsvik 等，1996；Ward 等，1990）。 目前 16S rRNA基因序列分析法弥补了这一缺陷。细菌16S rRNA基因，约为1540 bp，信息量丰富，且有种的特异性，是细菌染色体上最保守的基因（Gurtle等，1991）。利用16S rRNA基因序列分析法几乎可以鉴定所有的细菌，而且特异性强、稳定性好、效率高、成本低，对环境微生物种属鉴定具有重要意义。

本研究分离出的效应细菌中，大部分为芽孢杆菌属细菌。芽孢杆菌属细菌在环境中以内生孢子存在，为非致病性菌，可以分泌多种酶类，在发酵床垫料有机质分解过程中，发挥重要作用（李野等，2005）。研究表明，枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌不仅能高效降解猪排泄物和垫料中的有机质，还能产生抗生素，抑制病原菌的繁殖，改善生态环境（武亮，2010）。地衣芽孢杆菌被猪只舔食后，进入消化道能促进肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能，提高饲料利用率，增强猪的免疫力等。另外，本研究还分离出了粘滞沙雷氏菌和假单胞杆菌2株条件致病菌，它们在猪生物发酵床垫料中的作用以及对猪只的影响，仍需要进一步研究。

[1]布坎南R E.伯杰细菌鉴定手册（第8版）[M].北京：科学出版社，1984.

[2]程丽娟，薛泉宏，来航线，等，微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000.108～110.

[3]陈玉红，王荣祥，史家云，等.发酵床养猪技术示范与推广[J].畜牧与饲料科学，2010，31（3）：136 ～ 139.

[4]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科技出版社，2001.

[5]李野，张小平，张克强，等.蜡质芽孢杆菌DLSL-2发酵条件探讨及培养基优化[J].微生物学通报，2005，32（2）：45 ～ 49.

[6]凌云.禽畜粪便高效降解菌的筛选和应用：[硕士毕业论文][D].上海：华东师范大学，2004.

[7]武亮.猪粪好氧堆肥工艺及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究：[博士学位论文][D].武汉：华中农业大学，2010.

[8]Dojka M A，Hugenholtz P，Haack S K，et al.Microbial diversity in a hydrocarbon and chlorinated-solvent contaminated aquifer undergoing intrinsic bioremediation[J].Appl Environ Microbiol，1998，64：3869 ～ 3877.

[9]Gurtle V，Wilson V，Mayall B C.Classification of medically important clostridia using restriction endonuelease site differences of PCR amplified 16Sr DNA[J].Microbiol，1991，137：2673 ～ 2679.

[10]Mandels M，Sternberg D.Recent advances in cellulose technology[J].J Ferment Technol，1985，63（2）：127 ～ 134.

[11]Tam N F Y，Vrijmoed L L P.Effects of the inoculum size of a commercial Bacterial product and the age of sawdust bedding on pig waste decomposition in a pig-on-litter system[J].Water Management and Research，1993，11（2）：107 ～ 115.

[12]Torsvik V，So/rheim R，Gokso/yr J.Total bacterial diversity in soil and sediment communities—A review[J].Journal of Indianan Microbiology，1996，17：170～178.

[13]Ward D M，Waller R，Bateson M M.16S rRNA sequences reveal numerousuncultured microorganismsin anaturalcommunity[J].Nature，1990，345（6270）：63 ～ 65.