瘤胃微生物对牧草纤维降解的研究进展

扬州大学动物科技学院 徐 俊 侯玉洁 史仁煌＊ 刘 红 杨宏波 赵国琦

中国饲料工业协会 丁健

扬州大学试验农牧场 朱建明

上海光明荷斯坦牧业有限公司 苏衍菁

牧草对反刍动物来说必不可少，其经瘤胃发酵形成挥发性脂肪酸可为反刍动物提供70%～80%的能量，牧草纤维还对维持肠道健康和发挥最大生产潜力具有重要作用。然而，粗饲料在瘤胃中的降解率是决定其饲喂价值的关键因素（Sun，2006）。 植物形态、 结构 （Wilson和 Hatifield，1997）、 细胞壁组分 （Sun，2006）， 动物咀嚼行为（Pan 等，2003）和瘤胃内环境（Miron 等，2001）等因素均会影响牧草纤维的消化。研究表明，提高粗饲料降解率不但可以提高动物生产性能，还能减少营养物质流向环境造成浪费和污染 （Jung等，2011）。纤维的降解依赖于瘤胃内栖息的大量微生物，包括细菌、真菌和原虫等（Dijkstra和Tamminga，1995），它们共同作用将牧草纤维逐渐降解。本文主要介绍了瘤胃微生物对牧草的降解及影响纤维降解的因素。

1 瘤胃微生物对牧草纤维的降解

奶牛采食的粗饲料先经咀嚼和反刍作用将粗饲料变短，然后经瘤胃微生物进一步降解，微生物的降解作用是决定粗饲料降解率高低的关键因素。瘤胃中微生物主要包括细菌、真菌和原虫，细胞壁降解的80%由瘤胃中细菌和真菌完成，原虫的作用仅占 20%（Sun等，2007）。

1.1 细菌对牧草纤维的降解 在瘤胃中，黄色瘤胃球菌（R.flavefaciens）、白色瘤胃球菌（R.albus）和产琥珀酸丝状杆菌（F.succinogenes）是公认的分解纤维的三种优势菌，它们对植物细胞壁的降解作用已通过电子显微镜观察得到了充分证实（Jung 和 Engels，2001）。 瘤胃中 88%～91%的葡糖糖内切酶和木聚糖酶，70%的淀粉酶和75%的蛋白酶是由饲料颗粒中紧密吸附的微生物分泌（Koike 等，2003），因此，与饲料颗粒紧密吸附的细菌对纤维的降解起主要作用（Miron等，2001）。

瘤胃细菌对饲料颗粒的吸附和降解作用因牧草种类而不同（Sun，2006；Akin，1989）。 以黑麦草为研究材料的试验中发现，细菌可快速吸附于黑麦草上，15 min后细菌总数可达峰值（Edwards，2007）。黄色瘤胃球菌主要定植于黑麦草的表皮、薄壁组织和韧皮部边缘（Latham等，1978）。以羊茅草和鸭茅草为研究材料的试验中发现，羊茅草叶中不同组织部位的降解率不同，叶肉细胞和韧皮部纤维要比外周维管束鞘和表皮组织优先降解，表皮和薄壁组织可完全被降解，植物组织类型的不同会改变微生物吸附的种类和数量，黄色瘤胃球菌不易附着在叶肉组织细胞和木质部导管中（Sun等，2007），此外，羊茅草中纤维分解菌有70%是产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌（Cheng等，1984），它们可占细菌总数的0.1%～6.6%和 1.3%～2.9%（Krause 等，1999）。Shinkai和Kobayashi（2007）通过荧光原位杂交和实时荧光定量PCR的方法研究了产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌对鸭茅草的定植作用，产琥珀酸丝状杆菌可紧密吸附于横断面边缘及未降解的内部组织，黄色瘤胃球菌要比产琥珀酸丝状杆菌更倾向于吸附在叶鞘组织中，黄色瘤胃球菌对鸭茅草的降解起主导作用，其在瘤胃中的数量更多且降解茎杆的能力更强。Koike等（2003）通过竞争性PCR和尼龙袋法研究了绵羊中三种主要纤维降解菌对鸭茅茎的吸附和降解情况，结果表明，三种纤维分解菌的数量随时间的延长逐渐升高，且在24 h时产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的数量达到峰值，分别为109cfu/g干物质和107cfu/g干物质，而白色瘤胃球菌在48 h达到峰值，为106cfu/g干物质。茎中中性洗涤纤维降解率随时间的延长不断提高，这与细菌数量的变化趋势并非一致，可能是因为纤维酶活性滞后造成的。在鸭茅茎杆中吸附的细菌数量为产琥珀酸丝状杆菌>黄色瘤胃球菌>白色瘤胃球菌，这与瘤胃食糜中三种细菌的数量相吻合。产琥珀酸丝状杆菌是瘤胃食糜和牧草茎杆降解中最重要的细菌。

在对秸秆的研究中发现，当瘤胃中pH为6.0时，吸附在大麦秸秆中的细菌量可达峰值，且黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌吸附量会达到饱和状态，分别为33 mg/g干物质和23 mg/g干物质，它们在大麦秸秆中的吸附位点各不相同（Bhat和o/rskov，1990）。而将玉米秸秆机械破碎后发现，吸附于玉米秸杆上的纤维素分解菌和半纤维素分解菌的数量均得到显著提高，这更有助于秸秆的消化（Kozakai等，2007）。

1.2 真菌对牧草纤维的降解 真菌可穿透牧草的角质层屏障降解无法被细菌和原虫降解的木质化组织（Akin，1989），但真菌对低木质化组织的降解能力有限（Hobson 和 Stewart，1997）。 Wilson 和Hatfield（1997）研究指出，真菌可以减弱植物纤维组织的内部张力，使其变得疏松而易被瘤胃中微生物降解，虽然瘤胃中真菌远不及细菌多，但是真菌可以优先深入到植物纤维组织内部促进细菌的进一步降解（Varga和Kolver，1997）。真菌可以分泌多种降解植物细胞壁的酶，其中活性最高的是纤维素酶和木聚糖酶（Sun等，2007）。

瘤胃真菌可降解植物中的大部分多糖，并能溶解植物片段（Akin，1994）。研究发现，在体外纯培养中有40%～45%的麦秸片段干物质在4 d内消失，而约50%的纤维素和半纤维素被消化，约16%的木质素也被损失。瘤胃真菌还有水解蛋白质的能力，而纤维分解细菌则无此功能，真菌的假根可穿透植物组织的蛋白层，而这一层阻止了纤维菌进入细胞壁（Wallace 和 Joblin，1985）。

Karunanandaa等（1995）研究发现，用白腐真菌处理稻草的茎和叶，其体外干物质消化率可分别提高13%和30%，真菌处理造成维管束鞘崩裂，使微生物更易接触而促进叶肉组织的消化。Edwards等（2008）研究表明，黑麦草在瘤胃中培养5 min时即可发现真菌的存在，样品处理方法并不会影响真菌的定植。

1.3 原虫对牧草纤维的降解 研究表明，瘤胃中缺乏原虫时，细胞壁在瘤胃中的降解率下降（Williams和 Coleman，1992）， 且在原虫中发现有纤维酶的存在（Wang 和 McAllister，2002），因此，原虫也被认为在植物细胞壁的降解过程中发挥着重要作用（Sun等，2007）。目前研究最多的分解纤维素的原虫是真双毛属原虫（Eudiplodinium maggii），单个虫体可以吞噬148 ng的纤维素，它的消化速率达到 320 pg/min（Coleman，1992）。 除了内毛属原虫（Entodinium spp）以外，在所有内毛虫目（Entodiniomorphid）的原虫体内均含有纤维素酶，且纤维素酶活性最高的原虫是Eudiplodinium maggii、Epidinium ecaudatum caudatum 和 Ostracodinium obtusum bilobum。然而，由于原虫在体外很难培养和存活，因此，有关原虫对纤维降解作用的研究受到一定限制，有待于进一步深入探讨。

2 影响纤维消化的因素

2.1 动物采食、日粮处理和饲喂方式 动物采食、日粮处理、饲喂方式等均会影响微生物的生长和底物纤维的消化（Varga和Kolver，1997）。动物采食会影响瘤胃液和内容物的周转速率，而结构性碳水化合物的降解速率与食糜流通速率有关，且随动物采食量的提高而降低 （Russell等，1992）。将粗饲料粉碎和制粒后，纤维素酶与牧草的接触面积增大更易于微生物的降解。氨化或碱处理牧草可溶解半纤维素和木质素，进而提高牧草消化率（Fahey等，1993）。另外，日粮的饲喂形式和饲喂频率也会影响纤维的消化，饲喂营养物质均衡的全混合日粮、易发酵日粮，以及少量多次饲喂，均可促进瘤胃内环境的稳态，提高纤维分解菌的数量以及纤维消化率（Robinson，1989）。

2.2 微生物因素 细菌与底物的吸附能力是影响底物消化率的重要因素，也是植物细胞壁多糖降解的前提条件 （Fernando等，2012；Lynd等，2002）。微生物与底物的吸附可以在细胞和分子水平上影响其生理生化反应（R·oper和 Koch，1988）。

细菌间存在竞争关系，并会相互抑制与底物的吸附（Fernando等，2012）。当产琥珀酸丝状杆菌与瘤胃球菌同时存在时，产琥珀酸丝状杆菌的吸附数量明显受到抑制，这可能是与球菌黏附快而产琥珀酸丝状杆菌黏附慢有关。当产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌完成与底物的吸附后，添加白色瘤胃球菌并不影响其吸附，但出现部分已黏附的黄色瘤胃球菌的脱落，这可能是因为这两种球菌的黏附位点相同或在黏附过程中相互抑制所致，而球菌和产琥珀酸丝状杆菌的黏附位点不同（Mosoni等，1997）。当原虫与细菌或真菌共培养时，细胞壁的降解速度较各微生物单独培养时低，但真菌与细菌共培养时，出现互作效应，从而提高细胞壁降解率（Lee等，2000）。

底物中微生物密度会影响其对纤维的吸附能力，高密度环境下，细菌间的竞争则会严重影响对纤维的吸附和消化（Fernando等，2012）。某些细菌释放的多肽物质和累积的产物也会抑制微生物的吸附 （Pettipher和Latham，1979）。 细菌表面糖蛋白质也会影响细菌的吸附能力，当细菌表面糖蛋白变性或构象改变时，细菌对底物的吸附能力明显降低。当用高碘酸盐、戊二醛和蛋白酶去除产琥珀酸丝状杆菌表面的糖蛋白后，该菌与底物的黏附数量显著降低（Gong和Forsberg，1989）。然而，用叠氮化钠或甲醛杀死细菌，对细菌的黏附能力无影响，但是用加热的方法（蛋白完全变性）可以强烈的抑制细菌的黏附能力（Roger等，1990）。

2.3 底物因素 植物组织结构、细胞壁组分及其结构等均会影响纤维的消化，大多数植物表皮存在一层蜡质和角质层，阻止了微生物对粗饲料的黏附。瘤胃细菌通常是通过对气孔、皮孔或植物破损部位的入侵到达植物组织的内部进行对植物组织的进一步消化和降解 （McAllister等，1994）。与此同时，底物大小和形状也会影响微生物的吸附，饲料颗粒的表面积越大越有利于微生物对纤维的降解，因为瘤胃微生物可以更好地入侵到植物的内部进行附着和分泌纤维降解酶。反刍动物在进食时对粗饲料的咀嚼作用，可破坏粗饲料表皮的角质层，增大吸附表面积，暴露出更多的可消化位点供微生物利用，从而有利于牧草纤维的降解（McAllister等，1994）。

2.4 环境因素 温度的变化会显著影响瘤胃微生物的吸附能力。研究表明，产琥珀酸丝状杆菌在4、22℃和37℃条件下，对微晶纤维素的黏附率分 别 为 50%、79%和 82%（Gong和 Forsberg，1989）。在50℃以上时，白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的黏附率会降低，白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的黏附率均在 30～38 ℃时最大（Roger等，1990）。

pH对纤维分解菌的吸附作用的影响因不同细菌而异。对于产琥珀酸丝状杆菌，当pH由4.5上升到6时，该菌对底物的黏附力有所增加；当pH为6～7时，该菌的黏附力保持稳定；当pH大于7.5时，该菌的黏附力会急剧下降。对于黄色瘤胃球菌，当pH为3.3～7.5时，该菌的黏附力较稳定；当pH上升到8时，该菌的黏附力会逐渐下降。对于白色瘤胃球菌，当pH为5.5～8时，该菌的黏附力不受影响（Roger等，1990）。

底物中离子种类和浓度也会极大地影响瘤胃微生物的吸附。提高底物中Ca2+或Mg2+浓度时，产琥珀酸丝状杆菌对纤维的黏附作用会显著提高（Gong和 Forsberg，1989）。但 Roger等（1990）研究认为，产琥珀酸丝状杆菌对二价阳离子并不敏感，Na+对其黏附能力的影响更大。黄色瘤胃球菌的黏附能力并不单独受Ca2+、Mg2+或Na+的影响，不过当同时缺少两种二价阳离子时，黏附作用则会显著降低。

3 展望

牧草中的结构性碳水化合物是反刍动物重要的能量来源，而纤维的降解是影响牧草营养价值的关键因素，瘤胃中微生物对不同牧草的降解规律存在一定的差异，因此，明确瘤胃微生物对不同牧草的降解机制对合理利用牧草纤维至关重要。虽然，目前关于牧草纤维降解机制的研究已取得一定进展，但仍然有诸多问题尚未解决，如对不同牧草结构性碳水化合物瘤胃内降解机制、代谢转化途径、营养调控功能，以及对乳品质、肉质调控影响的研究还有待深入。与此同时，利用现代基因工程技术、蛋白质工程等方法，开展纤维分解菌和低木质化牧草育种以及新型高效纤维素酶的开发也将更有助于促进牧草在畜牧生产中的高效利用。

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