甲壳素、壳聚糖对水产动物免疫功能的影响研究进展

浙江大学动物科学学院 王 月 杨彬彬 邵庆均

在集约化程度不断提高的现代养殖模式下，营养缺陷、环境因素等易诱导水产动物发生疾病，并且一旦发病严重，极易以水生环境为媒介发生大规模的传播和感染，引起水产动物大量死亡。因此，水产动物疾病的预防工作成为水产养殖中极为重要的环节。从营养调控的角度增强水产动物的免疫能力成为防控水产动物疾病的研究热点。甲壳素和壳聚糖作为饲料添加剂，在调节水产动物的免疫功能、提高抗病能力等方面效果明显。

1 甲壳素和壳聚糖的理化性质

甲壳素，又称几丁质，是一种天然黏多糖，广泛存在于甲壳动物、昆虫的外壳及真菌、藻类的细胞壁中，自然界中其产量仅次于纤维素。天然甲壳素是聚2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖以1，4糖苷键连接而成的无分支的线形高分子聚合物。甲壳素是除蛋白质外数量最大的含氮天然有机化合物。甲壳素可以被溶菌酶、几丁质酶降解，具有较低的免疫原性，而生物相容性和生物降解性较好。甲壳素与纤维素结构十分相似，不溶于水和大多数有机溶剂，化学性质稳定（Ravi Kumar，2000）。

通常情况下，甲壳素在碱性条件下进行乙酰化处理的产物是壳聚糖。自然界中的多聚糖一般为酸性或中性，而壳聚糖是自然界中少有的碱性高聚物。因此，较易形成多氧盐、螯合金属离子等。程珊珊等（2011）研究报道，壳聚糖对水体中镉离子（Cd2+）和铅离子（Pb2+）具有较强的吸附作用。

2 甲壳素及壳聚糖的免疫促进作用

有研究认为，甲壳素及壳聚糖可以刺激机体的非特异性免疫，提高机体抵抗细菌及病毒的能力，并且具有抗肿瘤细胞的活性 （Nishimura等，1984）。

甲壳素和壳聚糖可以活化巨噬细胞和自然杀伤细胞来表达一些引起发炎反应的细胞因子，如白介素-1、集落刺激因子和γ干扰素等（Lee等，2008）。并且有研究还发现，甲壳素和壳聚糖的混合程度对其发挥免疫促进剂的作用有关，由30%甲壳素和70%壳聚糖混合后产生的活化巨噬细胞的作用比单纯的甲壳素或壳聚糖的作用效果更佳（Iida等，1987）。有的研究则报道，在抵抗念珠菌感染上，甲壳素促进免疫的作用与给予的剂量有关。

近年来也有试验表明，天然甲壳素因分子质量巨大、聚合度高而未表现出显著提高机体免疫指标的作用，相比之下，经过处理后分子量较小的壳聚糖或甲壳素片段则在增强免疫方面有着较强的作用。Shibata等（1997）首先在小鼠上用细小的甲壳素颗粒（1～10 μm）进行静脉注射，发现小片段的甲壳素可以活化肺泡巨噬细胞以表达如白介素-12、肿瘤坏死因子（TNF）-α 和白介素-18，并刺激自然杀伤细胞分泌干扰素INF-γ。并且进一步证明了这些细胞因子的产生是基于一种依赖甘露糖受体的细胞吞噬作用途径。甲壳素颗粒在甘露糖受体的协助作用下完成吞噬细胞的内化作用，再由巨噬细胞溶菌酶和N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶降解。

Reese等（2007）在研究甲壳素体内促免疫作用时，将甲壳素和壳聚糖颗粒由表达绿色荧光蛋白标记的白介素-4的小鼠鼻腔直接注入肺部，结果发现，几小时后一些分泌白介素-4的免疫细胞，尤其是嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞在肺部被大量募集。表明甲壳素可以活化一些非特异性免疫细胞，引起过敏类的发炎反应。

3 甲壳素及壳聚糖对水产动物免疫功能的影响

目前，针对甲壳素及壳聚糖对水产动物免疫功能的影响上研究报道较多，绝大多数是关于甲壳素及壳聚糖对水产动物非特异性免疫系统的影响，而很少涉及其对特异性免疫系统的作用。这可能与目前对水产动物特异性免疫系统的研究并不十分深入有关。近年来，随着虹鳟甲壳素结合蛋白的发现，关于甲壳素对鱼体免疫作用的研究进一步深入（Rusell等，2008）。甲壳素结合蛋白存在于虹鳟的鳃、脾脏、肝窦、肾间质肠、皮肤、鱼鳔以及白细胞内部。这种蛋白质与人和啮齿类的一种血浆凝集素属于同源蛋白。Schlosser等（2009）在小鼠体内也发现了一种甲壳素受体蛋白，这种甲壳素受体蛋白是一种由FIBCD1基因表达的同源四聚体跨膜蛋白，在包括鱼类的脊椎动物中结构比较保守，并在消化道中高度表达。这种受体通过一种与乙酰化的甲壳素或甲壳素片段高亲和性的钙依赖性途径参与到细胞内吞作用中。

3.1 海水鱼类 Esteban等（2000）用直径小于10 μm的甲壳素颗粒对金头鲷（Sparus aurata L.）进行静脉注射和腹腔注射，发现经腹腔注射的金头鲷其体液免疫和细胞免疫指标均显著提高。天然补体溶血活性在注射5 d后提高，但没有达到显著水平；呼吸爆发和吞噬细胞吞噬能力分别在3 d和5 d后达到峰值；细胞毒素活性在3 d后显著提高并一直持续至注射后10 d。而静脉注射对金头鲷的各项免疫指标均未产生显著影响。Esteban（2001）用甲壳素添加水平分别为25、50 mg/kg和100 mg/kg的饲料饲喂初重为（125±13）g的金头鲷，分别在第2、4、6周测定其各项非特异性免疫指标，结果发现，饲喂水平为25 mg/kg和50 mg/kg的金头鲷非特异性免疫得到显著提高；天然补体溶血活性和细胞毒素活性在饲喂2周后显著提高，呼吸爆发和吞噬细胞吞噬能力分别在饲喂甲壳素4周和6周后显著提高；而溶菌酶活性和生长性能则没有受到显著影响。试验结果表明，适量的甲壳素可以提高鱼体免疫功能，而添加量过高则可能不会起到提高免疫功能的作用。并且甲壳素对不同免疫指标的影响具有时间差异。Cuesta和Esteban（2003）研究进一步证明，甲壳素颗粒的大小对免疫细胞的吞噬能力也有影响。用含有不同大小的甲壳素颗粒的培养液培养金头鲷的白细胞，结果发现，白细胞只能吞噬直径小于10 μm的甲壳素颗粒，并在培养1～4 h后白细胞的吞噬能力得到提高，但其呼吸爆发未受到显著影响。金头鲷白细胞吞噬甲壳素颗粒很可能是通过甘露糖/岩藻糖受体途径，这种受体主要识别含氨基或亚氨基的抗原并激发白细胞的一系列免疫反应，目前仅在哺乳动物和金头鲷中发现，而在其他鱼类中尚未见报道（Cuesta 和 Esteban，2003）。

3.2 淡水鱼类 Choudhury等 （2005）给初重为（13.40±0.17） g 的露斯塔野鲮（Labeo rohita L.）饲喂甲壳素添加水平为25 mg/kg和50 mg/kg的饲料，15 d后发现，对露斯塔野鲮的增重率、特定生长率、饲料效率、蛋白质效率等均无显著影响，也未显著提高试验鱼的白细胞数量、呼吸爆发等免疫指标。用嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）进行攻毒试验后，饲喂甲壳素的试验鱼存活率未得到显著提高。这可能与甲壳素添加水平过低不足以起到免疫增强剂的作用有关。Gopalakannan和 Arul（2006）试验证明，鲤鱼（Cyprinus carpio）在饲喂1%甲壳素或壳聚糖后，其溶菌酶活性和利用NBT法测得鲤鱼嗜中性粒细胞呼吸爆发在饲喂30 d后达到峰值，并且饲喂壳聚糖组的溶菌酶活性约是饲喂甲壳素组的2倍，峰值过后虽一定程度下降但仍显著高于对照（P＜0.001）。45 d和90 d后用分别用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）进行攻毒试验，发现试验45 d后饲喂甲壳素和壳聚糖组的相对成活率分别是40%和80%，而90 d后分别降低到37.5%和68.9%。相对成活率是反映免疫促进剂或疫苗有效性的指标，一般大于50%即可视为有效提高免疫。试验结果表明，一定浓度的壳聚糖可以提高鲤鱼的非特异性免疫功能，并且作用效果优于甲壳素。华雪铭等（2007）研究了饲料中添加壳聚糖对暗纹东方鲀（Fugu obscurus）抗病力和免疫功能的影响。结果发现，用添加了0.2%、0.5%、1.0%的壳聚糖的基础饲料投喂平均体重为（3.15±0.05）g暗纹东方鲀 2个月后，脾脏自然杀伤细胞的杀伤活性显著提高；试验鱼的头肾B淋巴细胞体外培养时分泌的IgM显著增加。陈勇等（2010）以含0.50%壳聚糖A（分子量较小）和0.50%壳聚糖B（分子量较大）的基础饲料分别投喂2龄异育银鲫 （Carassius auratus gibelio），64 d后发现，两种壳聚糖均可显著提高异育银鲫外周血淋巴细胞数量、白细胞吞噬活性和脾脏溶菌酶活性（P＜0.05），显著降低外周血多形核细胞数量（P＜0.05），并且壳聚糖A能够显著提高异育银鲫脾脏B淋巴细胞转化能力；同时显著提高异育银鲫血清中T3的含量 （P＜0.05），显著降低异育银鲫血清中皮质醇和T4淋巴细胞的含量（P＜0.05）。试验结果表明，壳聚糖通过提高血清T3水平、降低血清皮质醇水平增强异育银鲫的非特异免疫功能。并且，试验也验证了壳聚糖分子量的大小可能影响其对鱼类细胞免疫的作用，分子量较小的壳聚糖具有更好的增强免疫的效果。翟少伟和刘淑兰（2011）与贾景涛等（2012）分别试验研究了水体中添加壳聚糖后对水环境镉或锌致罗非鱼（Oreochromis Niloticus）急性中毒的影响。结果表明，养殖水体中加入一定浓度的壳聚糖对镉或锌致罗非鱼急性毒性有显著改善作用，试验组鱼的病死率显著低于对照组。这可能与壳聚糖可以螯合水体中重金属离子的功能有关。

3.3 甲壳类 Powell和 Rowley（2007）在普通滨蟹（Carcinus maenas）的饵料中添加了 5%和10%的甲壳素，结果发现，试验组蟹成活率显著提高，但非特异性免疫指标并无显著改善，而肝胰脏和血淋巴中细菌总数显著低于对照组。这可能与甲壳素的添加改善了试验蟹的消化道微生物群系有关。Wang 和 Chen（2005）用 4、6、8 μg/g 的甲壳素和 2、4、6 μg/g 壳聚糖分别注射均重 （10.4±0.7） g凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的头胸部腹侧窦后，用溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）进行攻毒试验，6 d后发现，注射过甲壳素或壳聚糖组的试验虾成活率显著高于对照组，并发现注射6 μg/g甲壳素和4、6 μg/g壳聚糖的试验虾其血细胞总数和呼吸爆发在2 d后显著提高，酚氧化酶活性在注射6 d后一直保持较高水平。Zhu等（2010）用添加水平分别为5、10 mg/g和15 mg/g甲壳素或壳聚糖的饲料饲喂初重为20 g左右的克氏原螯虾（Procambarus clarkia），4周后用感染了白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的克氏原螯虾尾部肌肉饲喂试验虾进行攻毒试验。结果发现，10 mg/g壳聚糖饲喂组累积死亡率显著低于对照组（P＜0.05）。各试验组克氏原螯虾的血细胞总数、原酚氧化酶活性和双氧化物歧化酶活性（SOD）等免疫指标均显著提高。并且饲喂壳聚糖的试验组虾各项指标均显著高于饲喂甲壳素的试验组。

另外，也有研究证明，甲壳素或壳聚糖对某些水产动物的免疫功能无显著的改善作用。Lin等（2011）用添加了0.2%壳聚糖的饲料饲喂锦鲤（Cyprinus carpio koi），56 d 后发现，无论是白细胞总数，还是非特异性免疫的体液免疫、细胞免疫指标均未发生显著变化。

4 小结

综上所述，大量试验研究表明，适量添加甲壳素或壳聚糖可以增强水产动物的非特异性免疫功能、提高水产动物抵抗和防御病原微生物感染的能力。但是，目前为止对甲壳素和壳聚糖对水产动物的作用机理研究并不深入，因此可以借鉴其在小鼠等哺乳动物中的研究成果，为甲壳素和壳聚糖在水产动物中的研究提供引导和方向。

今后应针对以下问题进行深入研究：（1）进一步明确甲壳素和壳聚糖的作用机制和影响因素。（2）深入了解添加方式、给予途径、添加水平和颗粒大小对甲壳素和壳聚糖作用的影响，针对不同水产品种摸索最佳添加水平。（3）开展甲壳素、壳聚糖与其他免疫增强剂或饲料添加剂的协同作用研究。（4）在国内更多名贵养殖品种上展开研究。（5）探讨甲壳素的其他衍生物，如稀土甲壳素、壳聚寡糖对水产动物免疫功能的影响作用。

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