不同锌源对肉仔鸡肠道形态及金属硫蛋白表达的影响

东北农业大学动物科技学院 郑立鑫 刘华伟 吴鹏华

东北农业大学理学院 刘大森＊

东北农业大学生命学院 仝 泳

传统上用于鸡饲料中锌元素的补充多以无机硫酸锌为主，但其存在生物利用率低，易与饲料中其他营养素产生拮抗反应，含结晶水多易潮解等缺点。为解决这些问题，人们对各种形式的硫酸盐替代品进行了探索研究，其中，氨基酸螯合锌以稳定性强、利用率高、环境污染小等优点备关注（李素芬等，2001；武书庚等，2001）。本试验选取硫酸锌和市场常见的3种氨基酸螯合锌，根据肠道形态、金属硫蛋白（MT）含量及其在小肠的相对表达量研究了不同锌源对AA肉仔鸡的影响，旨在为肉仔鸡锌添加剂选择和应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验选用1种无机锌和3种氨基酸螯合锌。无机锌：硫酸锌（ZnSO4），ZnSO4含量大于99.50%，锌含量40.03%，购于天津博迪化工有限公司。氨基酸螯合锌：蛋氨酸锌（Met-Zn），Met-Zn含量大于79.00%，锌含量17.50%；赖氨酸锌 （Lys-Zn），Lys-Zn含量大于 58.00%， 锌含量10.50%；甘氨酸锌 （Gly-Zn），Gly-Zn含量大于66.00%，锌含量29.00%，3种螯合锌源均由广东天科有限公司提供。

1.2 试验设计与饲粮 选取480只商品代1日龄发育良好的AA肉公鸡 （购于哈尔滨德林鸡场），采用单因子完全随机设计，随机分成4组，每组6个重复，每个重复20只鸡。试验选用玉米-豆粕型基础饲粮（含锌量为22.68 mg/kg），参照美国NRC（1994）中家禽营养需要量中肉仔鸡营养建议量配制（表1）。在基础饲粮中分别加入Zn-SO4、Lys-Zn、Met-Zn 和 Gly-Zn， 配制成 4 种含锌量均为90 mg/kg试验饲粮，以ZnSO4组为对照组。动物试验管理按《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行。自由采食、饮水，24 h光照，试验期为21 d。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.3 样品采集与处理 21日龄试验结束后，每个重复选取2只肉鸡，每个处理12只，共48只。将鸡全部处死，立即摘取十二指肠、空肠和回肠中间部位5 cm，外翻后用灭菌生理盐水冲洗，再用灭菌载玻片刮下各肠段黏膜于Ep管中，-80℃冷冻保存，以备检测MT mRNA表达量；同时摘取肝、胰放于自封袋中-80℃冻存用于分析MT含量。然后摘取另1只鸡的十二指肠、空肠、回肠用灭菌生理盐水洗去食糜，置于10%甲醛中保存，用于制备小肠形态观测切片。

1.4 测定指标

1.4.1 小肠形态 取在10%甲醛溶液中固定24 h的小肠组织，按步骤依次进行水洗、透明、浸蜡、包埋处理，然后在室温下进行切片并染色封片。在美国moticam 3000显微摄影成像系统100倍下摄片，采用Motic Images Advanced 3.2病理图像分析系统测量十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD），并计算两者比值（V/C）。 其中绒毛高度以肠腺开口至绒毛顶端的垂直高度为准，隐窝深度以黏膜肌层至肠腺开口处的垂直高度为准。

1.4.2 小肠MT mRNA RNA的提取按照试剂盒说明书要求进行。用紫外分光光度计测定所提RNA在260 nm和280 nm的吸光度值，通过OD（260/280）值检测RNA纯度，并利用琼脂糖凝胶电泳成像分析系统检测总RNA完整性。检测后立刻对总RNA进行反转录，-80℃冷冻保存待用。随后按照试剂盒说明书要求进行荧光定量PCR操作。RNA的提取、反转录及荧光定量PCR所用试剂盒均购于大连宝生物有限公司，所需引物（表2）由上海生工合成。采用2–△Ct值法算出相对表达量。

表2 引物的设计与合成

1.4.3 肝、胰MT含量 MT含量测定参照成廷水（2004），采用镉血红蛋白亲和力分析法。

1.5 数据处理与统计分析 采用Excel 2003进行数据的初步整理。然后采用SPSS 17.0版统计软件中ANOVA进行单因素方差分析，并用Duncan’s法进行多重比较，试验结果均以“平均值±标准差”表示，以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 锌源对肉仔鸡小肠形态的影响 由表3可知，不同锌源对3周龄肉仔鸡小肠形态影响无显著差异（P>0.05）。与对照组相比，3种氨基酸螯合锌组十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度均有升高趋势，而隐窝深度均有降低趋势。

2.2 锌源对肉仔鸡小肠MT mRNA相对表达量的影响 提取的总RNA经分析测定，计算得其OD值均在1.8～2.0。对总RNA进行1%琼脂糖变性凝胶电泳检测，结果满足后续试验要求。从管家基因 （β-actin基因）与MT基因荧光定量PCR产物扩增曲线和溶解曲线图可以看出，无非特异性产物形成，结果表明PCR扩增片段均为单一特异性产物。

表3 不同锌源对肉鸡肠道形态的影响

由表4可知，Gly-Zn组和Met-Zn组十二指肠、空肠和回肠中MT mRNA相对表达量均显著高于对照组（P＜0.05），但Lys-Zn组与对照组差异不显著 （P＞0.05）；在3种氨基酸螯合锌中，Lys-Zn组十二指肠MT mRNA相对表达量显著低于其他两种螯合锌组（P＜0.05）；在空肠和回肠中的表达则与对照组差异不显著（P＞0.05）。

表4 不同锌源对小肠MT mRNA相对表达量的影响

2.3 锌源对肉仔鸡肝、胰MT含量的影响 由表5可知，Gly-Zn组和Met-Zn组胰脏MT含量显著高于Lys-Zn和ZnSO4组，分别较对照Zn-SO4组提高 32.21%（P＜0.05）和 26.54%（P＜0.05）。Lys-Zn组较对照组提高 8.27%（P＞0.05），但差异不显著。不同锌源对肝脏MT含量变化无显著影响（P>0.05）。

3 讨论

3.1 锌源对肉仔鸡小肠形态的影响 小肠是动物机体吸收营养物质的重要场所，小肠绒毛高度与隐窝深度是衡量小肠吸收能力的重要指标。Ewtushik等（2000）研究表明，小肠绒毛高度（V）与上皮细胞数量成显著的正相关，绒毛高度增加，则上皮细胞数量增多，吸收营养物质能力增强。隐窝深度（C）则能够反映上皮细胞的成熟度和增殖率，隐窝变浅，则细胞成熟度增强，吸收养分能力增强。两者比值（V/C）能够综合反映小肠吸收能力，比值升高则吸收能力增强。Tako等（2005）研究表明，锌能够促进细胞分裂增殖和蛋白质合成，进而改善小肠形态。因此，通过对小肠形态的测定能够在一定程度上反映出小肠对锌的吸收能力。赵润梅（2010）研究表明，与 ZnSO4相比，Met-Zn能够增加小肠绒毛高度、降低隐窝深度。冯江（2011）研究表明，Gly-Zn能改善小肠形态，但与ZnSO4间差异不显著。本试验中，与无机对照组相比，氨基酸螯合锌有增加小肠绒毛高度、减小隐窝深度的趋势，与上述研究结果大体一致。说明氨基酸螯合锌对肉仔鸡小肠形态的作用效果略优于无机锌。但试验中氨基酸螯合锌与无机锌间的差异并不显著，则可能因为试验各组锌的添加水平相同，而试验期又相对较短，肉仔鸡小肠绒毛高度、隐窝深度对锌源间差异的反应并不敏感，因此对小肠形态的改善作用并未能够完全体现出来。

表5 不同锌源对肝、胰MT含量的影响μg/g

3.2 锌源对肉仔鸡小肠MT mRNA相对表达量的影响 MT是一种富含半胱氨酸的小分子量金属结合蛋白，其特点是可以高亲和力与重金属结合。在鸡组织中，每个MT能够与7个锌原子结合，对锌的转运、贮存和分布发挥着重要的调节作用。锌则能够在转录水平上有效调控MT的基因表达，影响肠道MT的吸收效率（Davis等，1998）。虞泽鹏（2005）研究了同等锌添加水平的Met-Zn与ZnSO4对小鼠肠道MT mRNA表达的影响，结果发现Met-Zn组的相对表达量显著高于ZnSO4组。于昱（2008）在研究有机锌的吸收机制时发现，不同锌源对肉仔鸡肠道MT mRNA表达量的影响差异显著，弱络合强度氨基酸锌的相对表达量显著高于硫酸锌。本试验中，3种氨基酸螯合锌在十二指肠、空肠及回肠中MT mRNA的相对表达量均高于无机对照组，且Gly-Zn和Met-Zn组与对照组间差异显著，与上述研究结果大体一致。说明氨基酸螯合锌的环状结构稳定性更好，能够有效避免小肠内一些理化因子的干扰，使锌更易被转录因子利用而用于MT的转录。由此可以看出机体对螯合锌的利用效率更高。本试验中Lys-Zn在十二指肠中MT mRNA表达量显著低于其他两种螯合锌，原因可能与3种氨基酸螯合锌分子量大小不同有关，由于Lys-Zn的分子量较大，导致其通过小肠黏膜效率低于其他两种螯合锌，因而造成MT mRNA的相对表达量低于Gly-Zn和Met-Zn。

3.3 锌源对肉仔鸡肝、胰MT含量的影响 在肝脏和胰脏中，锌的主要贮存形式为同金属硫蛋白（MT）结合。而MT含量对饲粮锌变化的反应非常敏感。因此，很多试验研究把肝、胰MT含量的变化作为评定锌吸收利用效果的重要指标。冯江（2011）研究表明，Gly-Zn能够显著提高胰脏MT含量。刘泽辉（2011）研究得出，有机锌和ZnSO4间的肝脏MT含量差异不显著。本试验研究结果表明，4种锌源对肝脏MT含量变化无显著影响，但Gly-Zn和Met-Zn能够显著提高胰脏MT含量，与上述研究结果大体一致。说明胰脏MT含量变化能够成为反应不同锌源利用效果的敏感指标，由结果可以看出Gly-Zn和Met-Zn的利用效果更好。Rojas等（1995）研究表明，Zn-Lys饲喂的山羊肝脏MT含量显著高于无机锌组。曹家银等（2003）试验表明，氨基酸锌能显著提高肝脏MT含量。本试验中肝脏MT含量的差异并不显著，与上述研究结果不一致，这可能因为肝脏MT含量随饲喂时间的延长而导致作用敏感性降低，试验中长时间饲喂高剂量锌（90 mg/kg）很可能降低了肝脏MT的敏感性。另外，MT含量的变化还受到锌源之外其他因素的干扰（锌水平、动物应激、动物差异等）。因此，所得试验结果变化差异较大，有待后续深入研究。

4 结论

本试验结果表明，Gly-Zn与Met-Zn能够显著提高小肠MT mRNA表达量和胰脏MT含量，可有效促进锌的吸收与利用，相比ZnSO4和Lys-Zn，在肉仔鸡体内作用更高效。

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