5-甲基水杨酸的免疫原和抗体的制备与应用*

伍华琛，庄惠生

(1.上海交通大学a.环境科学与工程学院;b.环境监测评价研究所，上海 200240)

随着现代工业的迅速发展，环境中出现越来越多的有机微量污染物。其中医药品与个人护理品(PPCPs)因其种类繁多，用量巨大近年来受到科学界和公众广泛关注。PPCPs包括抗生素、止痛剂、抗癌剂、抗抑郁药以及麝香、化妆品、消毒剂等［1］。医药品经人体或动物摄入后，只有少部分发生代谢，大部分以原形最终通过尿液或粪便进入污水中。PPCPS则伴随沐浴、游泳等活动进入排污管后汇入生活污水。此外，一些不用和过期的药物则通过厕所丢弃等方式最终也会汇入到城市生活污水中。市政生活污水是PPCPs最主要的汇集源。

水杨酸(SA)是医药工业原料，被广泛用于化妆品中。SA经过直接排放或城市污水处理厂处理后进入环境及地表水，尤其是河流中已经广泛受到这类物质不同程度的污染。各种酚类化合物在生物体内可与由S-腺苷蛋氨酸提供的甲基结合，这个过程称为甲基化。

5-甲基水杨酸(5-MeSA)属于SA的一种代谢产物。目前对SA和5-MeSA残留的主要检测方法主要有:光度法［2，3］、荧光法［4］、化学发光法［5，6］、毛细管电泳法、电化学法、高效液相色谱法［7］以及气相色谱-质谱联用［8］法等。但是这些方法均存在着样品前处理复杂、耗时、成本高等问题。因此建立一种能够简单、快速、检测通量大的5-MeSA酶联免疫吸附免疫检测方法具有重要意义。

建立测定小分子有机污染物免疫分析新方法的关键技术在于小分子污染物的免疫原及其抗体的制备［9］。本文通过活性酯与碳二亚胺联合法(Scheme 1)或混合酸酐法(Scheme 2)将5-MeSA与牛血清白蛋白(BSA)偶联制得偶联比分别为14.6和3.4的免疫原(简称1和2)。用1和2分别免疫雄性新西兰大白兔得到两种多克隆抗体(简称3和4)。用间接竞争ELISA测得3和4的抗体效价分别为1∶256 000与1∶128 000。用3建立了测定5-SA的间接竞争ELISA法。该方法的 IC50为 149.04 ng·mL-1，最低检测限为 4.19 ng·mL-1;3与苯酚、对甲酚和邻氨基四甲基苯酚的交叉反应率＜0.1%。

Scheme 1

Scheme 2

该方法的建立，为进一步开发检测市政污水中5-SA及其他水杨酸类物质提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2012 PC型紫外可见分光光度计;Mnitiskan Mk3型酶标仪。

酶标板，生工生物(上海)公司;5-MeSA，BSA和OVA，国药集团化学试剂公司;磷酸盐缓冲溶液(PBS，c=10 mmol·L-1，pH 7.4);碳酸盐缓冲溶液(CBS，c=50 mmol·L-1，pH 9.6);辣根过氧化物-羊抗兔IgG偶合物(酶标记二抗)，Solarbio;实验用水为超纯水;其他试剂均为分析纯;新西兰大白兔，年龄3 m～4 m，体重2.0 kg～2.5 kg，上海交通大学农生学院动物实验中心。

1.2 制备

(1)1的制备

在锥形瓶中加入 5-MeSA 60.9 mg(0.4 mmol)和 DMF 400 μL，搅拌使其溶解;搅拌下滴加混合液(二环己基碳二亚胺64.8 mg+N-羟基丁二酰亚胺38.8 mg+DMF 200 μL～300 μL)，滴毕，于室温反应8 h;于4℃反应过夜。离心(9000 r·min-1，15 min)分离得上清液。

在上清液(400 μL)中滴加 BSA 150 mg的PBS 液(10 mL，0.02 mol·L-1)，滴毕，冰浴冷却下反应4 h。装入透析袋中于PBS中透析5 d;离心分出上清液即得全抗原1，分装于离心管中于-20℃冷冻保存。

仅改变5-MeSA 的用量［30.4 mg(0.2 mmol)］，用类似的方法制得1'。

(2)2的制备

在锥形瓶中加入5-MeSA 30.4 mg(0.2 mmol)和DMF 200 μL，搅拌使其溶解;加入正丁胺20 μL(0.2 mmol)和氯甲酸异丁酯 30 μL(0.2 mmol)，于4℃反应1 h。将反应液100 μL滴入BSA 75 mg的CBS(10 mL)溶液中，滴毕，于4℃反应4 h。装入透析袋中于PBS溶液中透析5 d;离心分离出上清液即得全抗原2，于-20℃冷冻保存。

用OVA 60 mg替代BSA 75 mg，用类似的方法制得2'(包被原)。

1.3 3和4的制备

酶联免疫检测最关键的步骤是得到亲合力高，特异性强的抗体。用免疫原免疫动物后获得的免疫血清为多克隆抗体。将1和2分别免疫新西兰大白兔，第三次免疫后每隔15 d通过耳缘静脉采血，离心后取上清液通过间接竞争ELISA方法测定抗体效价，待抗体效价达到试验要求，取兔子全血得上清以筛选出抑制率最好的抗血清抗体3和4。

1.4 偶联比的计算

将5-MeSA，BSA，OVA，1和2'配成一定浓度的溶液，用紫外分光光度分别于295 nm，285 nm，280 nm，278 m和275 nm处测得摩尔吸光系数(ε)，计算偶联比。

1.5 间接竞争ELISA法

将抗体稀释至最佳使用浓度后，每孔加入50 μL。将5-MeSA用50%乙醇配制成系列浓度［c=(0.01，0.1，1，10，25，50，100，250，1 000)ng·m L-1］，每孔加入50 μL，每块板做空白对照，然后按间接ELISA方法［9］操作。

分别用苯酚、对甲酚和邻氨基四甲基苯酚代替5-MeSA绘制标准曲线，分别得到各自的半数抑制浓度 IC50，计算交叉反应率［交叉反应率/%=IC50(5-SA)/IC50(替代物)×100%］。

2 结果与讨论

有效人工抗原的合成是建立小分子有机污染物免疫分析方法的前提和关键。由于5-MeSA本身就具有活性基团羧基，可直接通过交联剂与载体偶联。含有羧基的半抗原与载体耦联的方法比较多，具体有N-羟基丁二酰亚胺活性酯法、混合酸酐法、碳二亚酰法、烷基氯甲酸法等。其中以N-羟基丁二酰亚胺与碳二亚酰联用和混合酸酐法最常用。本文利用这两种方法合成多个免疫原1，1'，2和2'，并测定其偶联比，利用具有不同偶联比的免疫原进行免疫。

2.1 免疫原和包被原的鉴定

本文利用不同的合成方法合成了多个免疫原，进行紫外全波长扫描并计算偶联比。根据紫外全波长扫描结果和偶联比，选择不同偶联比的免疫原进行免疫。

图1为5-MeSA，BSA，OVA，1和2'的 UVVis谱图。从图1可见，半抗原5-MeSA在293 nm处有特征吸收峰，BSA和OVA在278 nm和279 nm处有最大吸收峰。与载体相比，1和2'的吸收曲线均发生了改变，说明已经有新的物质生成［10］。1与2'的最大吸收峰均出现在279 nm。另外2和2'在300 nm后仍有较高的吸收值，说明偶联物发生了紫移。合成后的溶液体系已不是载体蛋白和半抗原的简单叠加，从而确证了完全抗原偶联反应的发生。

图1 5-MeSA，BSA，OVA，1和2'的UV-Vis谱图Figure 1 UV-Vis spectra of 5-MeSA，BSA，OVA，1 and 2'

偶联率是指人工抗原中半抗原与载体蛋白的摩尔分子比。它是影响人工抗原免疫效果的重要因素。但是对于最佳偶联比却一直没有定论。过去曾经认为偶联比越高越好，但实验表明，在载体上覆盖过多的半抗原得到的效果不如预期。因为载体上覆盖过多的半抗原时，可能不利于载体与淋巴细胞的结合，从而使免疫原无法引起免疫反应。Schnieder等［11］均认为最佳偶联比为10～20。但也有一些实验结果表明偶联比为1时也可产生特异性抗体。虽然低偶联率的人工抗原引起的免疫反应较慢，但可获得高亲和力的抗体。

本试验利用不同的投料比与合成方法共合成了三个免疫原(1，1'和2)和1一个包被原(2')。三个免疫原和一个包被原的蛋白质浓度和偶联比见表格1。为了验证使用具有不同的偶联比的免疫原对产生抗体的影响，本试验选用样一与样四对新西兰大白兔进行免疫。

表1 抗原的浓度与偶联比Table1 Artificial antigen concentration and coupling ratio

2.2 抗体的制备与间接竞争ELISA法

本试验用间接 ELISA方法测得的样一免疫的一号兔，取全血得到抗体效价为25.6×104，抗体浓度为18.02 mg·mL-1。样四免疫的二号兔取全血，得到抗体效价为12.8×104，抗体浓度为20.97 mg·mL-1。

将标准5-MeSA溶液按间接竞争ELISA方法进行测定。以抑制率I为纵坐标，5-MeSA溶液浓度对数值为横坐标，绘制出标准曲线［抑制率I=A/A0(A为样品吸光度值，A0为空白对照吸光度值)］，结果见图2。从图2可知，R值接近50时对应的5-SA浓度的对数为2.17，该值恰好位于标准曲线的线性区间上，故该方法的半数抑制浓度为149.04 ng·mL-1。以抑制率为90%时的浓度作为最低检测限，可得最低检测限约为4.19 ng·mL-1。在(1～100)ng·g-1(mL)间，I=A/A0与lg(5-SA)有较好的线性关系系而且斜率也较大。该范围内的的线性回归直线方程为y=-20.36x+91.23，R2=0.992，可作为方法的最适浓度范围。

图2 5-MeSA的标准曲线Figure 2 Standard curve of 5-MeSA

5-MeSA与类似物的交叉反应结果为:5-Me-SA为100%，其余均 ＜0.1%，表明5-MeSA与结构类似物无交叉反应。

3 结论

通过混合酸酐法和活性酯法与碳二亚胺联合法合成5-甲基水杨酸免疫原和包被原。结果表明，混合酸酐法合成的免疫原偶联比较高。活性酯法与碳二亚胺联合法合成的低偶联比的免疫原也可用来制备抗体，但是混合酸酐法合成的偶联比高的免疫原免疫动物得到的抗体效价较高。这可能是由于暴露基团较多，获得了较高的免疫应答。

ELISA法与传统的动物生物法及色谱方法相比较，更快速经济，可以满足大批量样品的快速筛查需要。本文利用效价为25.6×104抗体建立的ELISA方法中5-甲基水杨酸的浓度与吸光值具有较强的相关性，相关系数 R2＞0.9。分析5-甲基水杨酸最低检测限为4.19 ng·mL-1，满足国际规定的20 μg·g-1的安全限值测定要求。测定5-甲基水杨酸的最适范围为(0～100)ng·mL-1。

本文为其他水杨酸类物质的免疫分析方法的建立提供了参考依据，拟用于市政污水中5-甲基水杨酸的检测。

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