福州地区汉族群体15个STR基因座遗传多态性研究

纪凤卿 藤 菁 赖 力 韩丽丽 沈晓丽▲

1.福建省厦门市中医院检验科，福建厦门 351009；2.福建省立医院司法鉴定所，福建福州 351004

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）又称微卫星DNA（micro satellite DNA），是一种广泛存在于人类基因组中可遗传、不稳定、且具高度多态性的DNA序列[1]。目前人类基因组内已发现了七千个以上的STR位点，平均每15kb就存在一个STR基因座。由于STR核心单位重复数目的变化，构成了STR基因座的遗传多态性。STR基因座因其分布广泛、信息量大，基因片段短、扩增效率高、易于检测，判型准确，且具有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等诸多优点，已广泛应用于遗传连锁分析、肿瘤等疾病相关基因的定位、器官移植、人类遗传学、法医学亲权鉴定及个体识别、身源认定等研究领域。由于STR 的基因频率和基因型的分布在不同地区之间存在差异，法医学应用价值及特点都有所不同，因此，各实验室利用STR 遗传标记开展群体遗传学研究及法医鉴定工作[2]，国内外许多DNA 实验室致力于DNA 检测基因座的群体遗传学研究[3-6]，以寻找到适合于不同民族、不同群体个人识别和亲权鉴定的基因座。本研究对350例福建福州地区汉族无关个体的15个STR基因座遗传多态性进行调查，并对其应用进行评估。

1 材料与方法

1.1 样本

取来自福建省立医院司法鉴定所2012年3月～2013年1月的日常检案，总共350例无关个体，均来自福州五区八县地区汉族人群。

1.2 DNA提取

采用chelex-100快速提取法从血样中提取DNA，经DNA浓度测定符合标准后-20℃保存。

1.3 试剂

AmpFlmSTR IdentifilerTM 试剂盒（ABI，美国）。

1.4 PCR扩增

PCR反应在Eppendorf Master Gradient型PCR扩增仪上进行，反应体系和条件严格按说明书进行操作。

1.5 毛细管电泳

将PCR扩增产物与DNA分子量标准550及去离子甲酰胺（HIDI）混匀，95℃变性 3min，立即冷却到 4℃，在Applied Biosystems 3130遗传分析仪上进行毛细管电泳。

1.6 荧光检测分型

用基因扫描软件（Date collection）检测扩增片段的荧光标记，以LIZ-550等为内标，根据扩增的STR片段大小确定STR基因座，以等位基因梯阶（Ladder）为标准，用基因分型软件（Genemapper ID v3.1）确定15个常染色体STR基因座的等位基因型。

1.7 统计学处理

运用PowerMarker V3. 1软件及Modified-powerstate 软件记录无关个体的基因型，对15个STR 基因座进行Hardy-Weinberg平衡检验，计算各STR 基因座等位基因数目及基因型数目、等位基因频率、杂合度观察值Ho、个人识别DP、非父排除概率 PE、多态信息含量PIC 以及该15个基因座的累计个人识别率TDP、累计非父排除概率 CPE。

2 结果

350份福州地区汉族无关个体15个STR基因座的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），具体见表1。350例福州地区汉族无关个体发现的稀有等位基因情况见表2。检测的15个STR遗传标记均具有高度多态性，除基因座TPOX外，其他基因座杂合度均超过0.60， 匹配概率 0.032～0.225，个体识别力 0.775～0.968， 多态性信息含量0.55～0.86，非父排除率0.285～0.761，具体见表3。

表1 福州地区汉族群体15个STR基因座等位基因频率

表2 福州地区汉族群体15个STR基因座的各项法医遗传学参数

表3 福州地区350个无关个体发现的稀有等位基因情况

3 讨论

3.1 应用STR 基因座作为亲子鉴定的优点

STR 基因座在人类基因组中分布广泛，基因片段长度差异较小，容易扩增，各基因座的扩增条件相似，没有优先扩增的问题，适用复合扩增，简化程序，分型规范，自动化程度高，效率高[7]。本研究对15个STR基因座进行基因分型，其重复单位在3～5bp，因此分型结果稳定，可重复性好，符合理想STR基因座的条件。

3.2 IdentifilerTM体系15个STR基因座在福州汉族人群中的法医学应用评估

这15个STR基因座在福州地区汉族人群中基因频率分布均匀，表现出高度多态性，分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。Gin等[8]认为DP≥0.9，H≥0.7的基因座具有高鉴别力。按此标准，本研究选择的10个基因座 D8S1179、D13S317、D19S433、D18S51、D21S11、D16S539、vWA、D5S818、D2S1338、FGA属于高鉴定力、高杂合度的基因座。这15个STR基因座具有较高法医学个人识别和亲子鉴定运用价值。通常情况下检测这些试剂盒的STR 基因座已能够基本满足法医物证中个体识别和三联体亲子鉴定的检测要求。但是在一些二联体和出现了突变可能的三联体案件中，需要增加检测更多的STR 基因座。有关方面的研究进展还待于学者们进一步的探索。一方面STR 基因座具有高度多态性， 另一方面，STR 的突变率也很高[9-10]。故2010年由司法部制订出台的亲权鉴定技术规范中对常染色体STR基因座的选择有明确的要求[11]：（1）经过群体遗传学调查，多态性高，非父排除率在0.7以上。（2）经过500次以上减数分裂的家系调查，基因座的突变率在0.002以下。按此标准，IdentifilerTM体系15个STR基因座在福州汉族人群中的非父排除率只有D18S51、FGA两个基因座满足0.7以上，其余13个基因座并没达到此标准。同类的现象在本地区曾健等[12]学者的研究中也见报道。本研究认为可能是IdentifilerTM体系的15个STR基因座主要是针对欧美群体而设计的，并非完全符合福州地区人群个体识别和体亲子鉴定的检测要求。为此学者必须进一步寻求更符合该地区鉴定要求的新的STR基因座。

3.3 福州汉族人群中所发现罕见等位基因的应用价值

当大量群体进行STR分型时，往往会发现一些新的等位基因。由于这些等位基因在等位基因阶梯中没有对应大小的片段，通常需要自己去定义，在实践中称这些等位基因[13]为“off-ladder（OL）”等位基因，即罕见等位基因。本研究所发现稀有等位基因均在美国国家标准和技术研究所（NIST）STRBase网站上公布的各种常用STR基因座的“offladder ”等位基因范围内。其类型有两种[14]：一是超出该基因座ladder范围的罕见等位基因（第一类型）；二是出现在两个等位基因之间的罕见等位基因（第二类型）。国内学者徐志成等[15]用IdentifilerTM系统对罕见等位基因及其频率的研究提出，IdentifilerTM检测系统中，ladder主要以欧美等西方人群遗传背景为基础制备，而 STR基因座的核心序列，在不同种族的人群中分布差异较大，因此该体系并不完全适用于中国人群的基因检测。这些罕见等位基因的出现，给检测结果判读带来一定的困难。而本研究也认为罕见等位基因的存在及其确定，有助于提高各STR基因座的个体识别能力、非父排除率等。同时也提示各试剂生产公司应制备更加完善的、 适合中国人群的 ladder以分析这些数据。尤其在试剂国产化的过程中更加要注重这方面数据的收集，并将这些数据放在ladder中，使DNA个体识别和亲权鉴定的试剂更加符合中国人群。当然，若要发现更多稀有等位基因，无疑需要进一步扩大群体数量。

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