HPLC法测定化妆品中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物

赵美丽

(江西省化学工业学校，江西 南昌 330012)

1.前言

众所周知，化妆品具有美白、保湿、滋润等功能，这些功能归咎于各种各样有效成份的作用结果，而这些有效成份本身多是油脂或者营养成份，极易受到微生物感染而发生变质腐败，导致产品质量下降。防腐剂是指可以阻止产品内微生物的生长或阻止与产品反应的微生物生长的物质，在化妆品中，防腐剂的作用是保护产品，使之免受微生物污染，延长产品货架寿命，确保产品的安全性，防止消费者因使用受微生物污染的产品而引起可能的感染。随着化妆品行业的迅速发展以及人们对化妆品的功能要求日趋多样，更多的活性成份用于化妆品中，选择一个高效而安全的防腐体系是当前化妆品配方非常关注的问题［1］。

化妆品中常用的防腐剂有甲醛供体和醛类衍生物防腐剂、苯甲酸及其衍生物防腐剂、醇类防腐剂及其他有机化合物防腐剂。本文要测定的就是有机化合物防腐剂中的异噻唑啉酮类——甲基异噻唑啉酮及其氯代物，俗称凯松［2］。甲基异噻唑啉酮及其氯代物类通常作为防腐杀菌剂，活性成分为5－氯－2－甲基－4－异噻唑啉－3－酮(甲基氯异噻唑啉酮)、2－甲基－4－异噻唑啉－3－酮(甲基异噻唑啉酮)，广泛用于化妆品、个人护理品、涂料、等行业防腐杀菌。

甲基异噻唑啉酮和甲基氯异噻唑啉酮为化妆品中常用的广谱杀菌防腐剂，但人体皮肤接触高浓度的甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮可引起过敏性皮炎。因此有必要对化妆品中甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮的浓度进行严格控制。目前我国《化妆品卫生规范》(2007年版)规定甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮为限用物质［4］。

我国《化妆品卫生规范》对化妆品中防腐剂的使用浓度和范围做了相关的规定。由目前资料得知，甲基异噻唑啉酮及其氯代物的测定方法主要有高效液相色谱法［5］、气相色谱法［6］等。

2.实验部分

2.1 仪器与试剂

2.1.1 仪器:

Agilent 1200高效液相色谱仪;KQ5200DB型数控超声波清洗仪;湘仪离心机 (H－2050R);电子天平(A8304 －S/FACT);滤膜(0.45μm 有机)。

2.1.2 试剂:

甲醇:色谱纯试剂(美国Tedia公司);甲级异噻唑啉酮及其氯代物的对照品(供含量测定用)，购于中国药品生物制品检定所;样品，由实验室提供。

2.2 色谱条件

色谱柱:Agilent TC －C18(250mm ×4.6mm，5μm);

流动相:甲－醇水(25:75，体积比);

波长:276nm;

流速:1.0mL/min;

柱温:室温;

进样量:10μL。

在上述色谱条件下，甲基异噻唑啉酮及其氯代物与样品中其他成分得到良好的分离，样品、空白溶剂、甲基异噻唑啉酮及其氯代物对照品色谱图如下(2.1)。

图2.1 样品色谱图

图2.2 空白溶剂图

图2.3 甲基异噻唑啉酮及其氯代物对照品图

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液的制备

甲基异噻唑啉酮及其氯代物标准混合储备溶液:分别准确称取甲基异噻唑啉酮0.05160g、甲基氯异噻唑啉酮0.1118g，精确到0.0001g于 50ml烧杯中，加适量甲醇溶解，溶液定量移入100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀。此溶液中甲基异噻唑啉酮的浓度为516mg/mL、甲基氯异噻唑啉酮浓度为1118mg/mL，储备液放入冰箱冷藏保存。

2.3.2 供试品溶液的制备

称量化妆品试样0.6000g，置于50ml具塞锥形瓶中，加入15mL甲醇，超声提取20min，将提取液移入25mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀。取约10m L于离心管中，在6000r/min下离心20min，离心后的上清液经0.45μm滤膜过滤，所得滤液供液相色谱测定。

3.方法与结果

3.1 方法

3.1.1 标准工作曲线的制备

甲基异噻唑啉酮及其氯代物标准工作液:移取混合储备液(2.3.1)，分别配制成甲基异噻唑啉酮浓度为0.516、2.58、5.16、25.80、51.60μg/mL 的标准工作溶液，甲基氯异噻唑啉酮浓度为 1.118、5.59、11.18、55.90、111.80μg/mL 的标准工作液。

分别准确吸取甲基异噻唑啉酮及其氯代物标准工作溶液按浓度由稀到浓顺序注入液相色谱仪，按色谱条件(2.2)进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准曲线，由此可得出甲基异噻唑啉酮及其氯代物的线性方程为:

甲基异噻唑啉酮:Y=34.98 X+20.65，R=0.99790

甲基氯异噻唑啉酮:Y=22.77 X －10.97，R=0.99994

测定结果见表3.1及图3.1－图3.2。

表3.1 线性关系曲线表

图3.1 甲基异噻唑啉酮标准曲线

图3.2 甲基氯异噻唑啉酮标准曲线

3.1.2 精密度试验

精密吸取供试品溶液(2.3.2)10μL，重复进样 6次，测得样品中甲基异噻唑啉酮及其氯代物的峰面积的结果见表3.2。

表3.2 精密度试验表(n=6)

2115.53 147.853117.02 150.054117.45 147.995116.77 149.116116.15 149.04 RSD% 0.59 0.56

3.1.3 稳定性试验

取供试品溶液(2.3.2)，分别于0小时，2小时，4小时，6小时及8小时进样10μL，测得样品中甲基异噻唑啉酮及其氯代物的峰面积，结果见表3.3。

表3.3 溶液稳定性试验(n=5)

3.1.4 重现性试验

按拟定的含量测定方法，对同一批样品分别制备样品供试液(2.3.2)，测得峰面积并计算含量，RSD%〈2%，结果见表3.4。

表3.4 重现性试验(n=6)

3.1.5 回收率试验

取经过测定的供试品溶液(2.3.2)中不含甲基异噻唑啉酮和甲基氯异噻唑啉酮的化妆品，各0.5g，分别加入甲基异噻唑啉酮及其氯代物标准储备混合溶液(2.3.1)为 50μL、100μL、200μL、400μL、800μL 按前处理方法处理过后，用液相色谱测定，结果见表3.5。

表3.5 加标回收率试验(n=5)

3.1.6 样品测定

仪器自动进样器吸取10μL供试品溶液(2.3.2)注入液相色谱仪，按色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。由色谱峰的峰面积可从标准曲线上求出相应的被测物浓度。供试品溶液中，甲基异噻唑啉酮和甲基氯异噻唑啉酮的相应值均应在仪器测定的线性范围内。被测物含量高的试样可取适量供试品溶液用甲醇稀释后进行测定。如表3.6以及图3.3－图3.7。

表3.6 不同供试品的测定结果

图3.3 保湿面膜

图3.4 沐浴露

图3.5 精华露

图3.6 润肤露

图3.7 面霜

3.2 结果的讨论

3.2.1 供试品前处理

由于凯松化学性质比较稳定，萃取溶剂(甲醇)的用量，超声波提取时的温度及时间对测定影响不大，对于膏体样品，可用玻璃棒将其均匀涂布于试管壁上再称量，这样有利于膏体中被测组分的超声提取。

3.2.2 流动相的选择

当甲醇－水的体积比为50∶50时，甲基异噻唑啉酮的保留时间为4.563 min，供试品溶液在该保留时间附近有较多的色谱峰，易产生干扰。降低甲醇－水的体积比有利于被测物与杂质的分离，当其体积比为25∶75时，甲基异噻唑啉酮的保留时间为4.515 min，甲基氯异噻唑啉酮的保留时间约为10.850min，二者均能与杂峰分开，峰形良好。当甲醇－水的体积比为20∶80时，被测物峰形欠佳，且出峰时间较长。最终确定流动相甲醇－水的体积比为25∶75。

3.2.3 色谱峰的确认

在处理甲基异噻唑啉酮及其氯代物的数据时，需要分辨所出峰是否是为我们所要的色谱峰，一要看时间，一般甲基异噻唑啉酮的保留时间为4.515 min，甲基氯异噻唑啉酮的保留时间约为10.850min，但这并不是绝对的，有时色谱峰会发生漂移，我们就需要靠光谱图来确定是否是凯松的色谱峰，甲基异噻唑啉酮和甲基氯异噻唑啉酮光谱图如图3.8－图3.9。

图3.8 甲基异噻唑啉酮光谱图

图3.9 甲基氯异噻唑啉酮光谱图

3.2.4 方法检出限

在本方法中，甲基异噻唑啉酮检出限2mg/kg甲基氯异噻唑啉酮检出限10mg/kg。《化妆品卫生规范》中液相色谱法测定防腐剂中甲基异噻唑啉酮的检出限0.00005%，甲基氯异噻唑啉酮检出限0.0002%，本方法检出限比《化妆品卫生规范》低，且方法简单快速。

［1］袁仕杨，叶志.化妆品用防腐剂浅谈［J］.化工与材料，2009，130(9):29 －30.

［2］王萍，柳玉红.我国化妆品用防腐剂及分析方法的研究进展［J］.环境与健康杂志，2007，24(7):557 －559.

［3］简龙海，闻宏亮，孙健，等.液相色谱－串联质谱法同时测定化妆品中的甲基异噻唑啉酮和甲基氯异噻唑啉酮［J］.中国卫生检验杂志，2011，21(11):2652－2653.

［4］王超，王星，马强，等.反相高效液相色谱法测定化妆品中的24种防腐剂［J］.分析化学研究报告，2007，35(10):1439 －1443.

［5］刘奋，戴京晶，梁伟，等.气相色谱法测定化妆品防腐剂凯松［J］.现代预防医学，2004，31(6):872－873.