非小细胞肺癌中Survivin的表达及其临床意义的研究▲

覃国亮 马广耀 冼 磊 陈铭伍

(广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021)

肺癌是中国常见的恶性肿瘤，NSCLC在其中又占了大多数，现肺癌已经成为死亡率最高的恶性肿瘤［1］。国内外研究表明，肺癌的发生发展与许多因素有关，其中凋亡是一个重要因素。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)中的Survivin是近年来凋亡研究的热点之一。本文采用RT-PCR检测80例NSCLC组织和60例癌旁组织中Survivin基因的表达，研究Survivin基因在NSCLC组织中的表达及其与肺癌临床病理特征的关系，为肺癌的临床诊断和综合治疗提供参考依据。现报告如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选择广西医科大学第一附属医院2007年5月至2008年10月手术切除的NSCLC标本80例和距离肿瘤边缘5 cm外的癌旁肺组织60例(部分标本因手术切除范围不足未纳取)，其中男53例，女27例，年龄40～76(58．0±6．7)岁;按 2004年 WHO肺肿瘤分类标准分类，其中鳞癌45例，腺癌35例;按分化程度分类，低分化25例，高、中分化55例;临床分期根据1997年肺癌国际分期标准进行分期，早期(Ⅰ～Ⅱ期)59例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)21例;有淋巴结转移31例，无淋巴结转移49例(均经过病理证实);长期吸烟47例(每天吸烟≥20支，连续20年以上)，不吸烟或少吸烟33例。所有患者术前均未接受新辅助化疗或放疗。研究的方案及详细事项已经在研究开展前向患者说明并由患者签署同意书，本项研究也已经得到广西医科大学第一附属医院伦理委员会的批准。

1．2 标本采集 肿瘤组织标本均在标本离体30min内取材，肿瘤组织标本在切取时均来源于肿瘤实质部分，并且尽可能避开坏死组织，距离肿瘤边缘5cm外癌旁肺组织标本取材方法同肿瘤标本，然后焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水清洗杂质及血凝块，无菌纱布沾干水分后保存在液氮罐中，并转移至－80℃冰箱采用新鲜冰冻的方式保存直到研究开展。

1．3 RT-PCR法 使用Trizol法提取标本的总RNA，用1%琼脂糖凝胶将提取后的总RNA电泳并使用凝胶数字成像系统(美国BIO-RAD)观察结果。结果参考标准:如果有28S、18S及5S三条带出现，并且28S条带的亮度是18S条带亮度的两倍，说明总RNA并未出现降解，其相对分子量分布正常。通过以上标准筛选符合实验条件的总RNA进行cDNA逆转录。逆转录试剂盒为美国Fermentas公司的RevertAidTMFirstStrandcDNA，逆转录后的cDNA及时使用或存放于－20℃环境下备用。设计引物后由上海捷瑞公司合成所需检测的基因及内参引物。Survivin目的基因序列:Forward5'-GGAAGGGTTGTGAATGA-3';Reverse5'-TTGGCTTGCTGGTCTC-3'。β-actin基因作为内参:

Forward5'-CTCGCGTACTCTCTCTTTCTGG-3';

Reverse5'-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3'。PCR反应体系为25μL:其中模板1μL，上、下游引物各1 μL，TakaraPremixExTaqVersion2．0(Loadingdye Mix)12μL，最后 ddH2O10μL补足25μL反应体系。94℃预变性 4min，94℃变性 45s，56℃退火 45s，72℃延伸45s，进行33个循环，最后72℃延伸7min，4℃下凝胶电泳观察结果或4℃进行保存。

1．4 观察指标 将6μLPCR反应产物在滴加溴化乙锭的琼脂糖凝胶(浓度2%)中均匀加样，电泳缓冲液为0．5×TBE，β-actin基因作为内参进行检验，并同时设置阴性对照，通过30min的120V恒压电泳后，将凝胶放入Bio-RadGelDoc2000凝胶成像系统，判断标本中有无扩增所需基因的特异性片段，在标本对应内参正常时，出现目的基因条带的表示此基因阳性表达，没有出现的则为阴性表达，电脑拍照并记录。

1．5 统计学方法 使用SPSS13．0统计软件对数据进行统计分析。计数资料的比较采用χ2检验或者Fisher精确检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 Survivin基因电泳 应用RT-PCR方法对非小细胞肺癌组织及癌旁组织的Survivin基因进行检测，结果获得片段为 131bp，内参片段为 334bp，见图1。80例NSCLC及60例癌旁组织中Survivin基因的表达水平分别为 67．75%(55/80)和 41．67%(25/60)。肺癌组织中Survivin基因表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=10．269 ，P=0．001)。见表1。

图1 SurvivinRT-PCR琼脂糖电泳图

表1 非小细胞肺癌组织及癌旁肺组织中Survivin基因表达情况

2．2 Survivin表达与临床、病理等特征的关系 肺癌组织中Survivin基因表达与肺癌患者性别、年龄、吸烟与否、肿瘤大小、病理类型和分化程度均无关(P＞0．05)，与淋巴结转移及临床分期有关(P＜0．05)。见表2。

表2 Survivin表达与肺癌临床病理特征的关系

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤，严重威胁人类健康［2］。愈来愈多的研究表明肺癌的发生与发展与细胞增殖异常以及凋亡平衡失调有关，平衡的破坏为存在基因缺陷的细胞提供生存空间，促使细胞向恶性转化，最终导致肿瘤发生和发展。

1997年耶鲁大学的Altier用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)在人类基因组库中发现了一个新的基因，命名为Survivin［3］。Survivin定位于17q25，基因长约15kp，含有4个外显子和3个内含子，其编码产物是由142个氨基酸组成的蛋白，分子量16．2 KD。Survivin基因可以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。其具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能［4］。

国外研究发现，Survivin蛋白特异地表达于细胞周期G2/M期，G1期检测不到，他主要通过级联式激活并溶解蛋白质，这表明Survivin是一个细胞周期调节基因［5］。他一方面直接或间接地抑制凋亡终末效应蛋白caspase的活化从而阻止细胞凋亡;另一方面通过与纺锤体纤维结合，间接抑制caspase对纺锤体的水解，保护有丝分裂的完整性，从而抑制细胞的凋亡。有研究发现，肿瘤组织中Survivin在肺癌组织中表达而在正常组织中不表达或低表达，根据这个特性对判断肺癌的预后有重要的意义。Survivin蛋白过度表达通常提示对放、化疗的敏感性较低，预后较差;应用RNA干扰Survivin蛋白的表达可以诱导癌细胞凋亡，抑制肿瘤生长，还可提高肿瘤对放、化疗的敏感性［6］。提示Survivin基因可能将是治疗NSCLC的一个新靶点。

本研究中Survivin在NSCLC中表达率达67．75%，高于癌旁组织中41．67%的表达(P＜0．05)，其表达与患者的性别、年龄、吸烟与否、肿瘤大小、病理类型、分化程度无关，而与淋巴结转移与否以及临床分期有关，与国内外的文献报道一致［7～9］。Survivin基因在肺癌组织中高表达，说明他可能通过抑制癌细胞凋亡而对肺癌的发生发展起重要作用。Survivin基因表达与临床分期及淋巴结转移与否有一定相关性，病人临床分期越晚，局部晚期的表现越明显(有淋巴结转移)，则Survivin基因阳性表达率也越高，这表明Survivin基因的阳性表达与疾病进展密切相关，越晚期的肺癌患者的标本中越有可能检测到Survivin基因阳性表达。

大量的研究证明，Survivin基因可作为肿瘤的特异性生物学标记物，其不仅为非小细胞肺癌的临床诊断和预后判断提供可靠的依据，还是基因治疗的目的基因。目前研究Survivin基因在肺癌中的治疗主要有以下几个方面:①针对Survivin基因的反义寡核苷酸来抑制其表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡以达到抑制肿瘤生长的目的［10］;② Survivin反义核酸的表达能够快速诱导细胞凋亡．同时伴有靶细胞增殖的下降［11］;③Survivin基因与肿瘤血管生成有密切关系，抑制Survivin基因有可能可以抑制肿瘤血管生成［12］。随着对Survivin研究的深入，其有望成为新的肿瘤诊断标志物和基因治疗靶点，为肺癌的诊断和治疗带来希望。

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