表达鸡毒支原体TM 1蛋白基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

冯秋霖，刘茂军，祁 芳，陈 曦，邵国青，葛金英*，步志高*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室，黑龙江哈尔滨 150001；2.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京 210095）

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）主要引起鸡慢性呼吸道疾病，降低机体免疫力，导致其它病原的继发感染，属于危害养鸡业的重要疾病之一[1]。

MG是一种缺乏细胞壁的革兰氏阴性菌。呈高度多形性，以二分裂法或芽生方式增殖。在MG基因组DNA中TM 1基因编码一个分子量为29 ku的外膜保护性抗原蛋白，在鸡体内能诱导产生保护性抗体[2]。将该纯化的蛋白接种鸡后，通过攻毒实验证明可保护80%的免疫鸡免受MG感染。

新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗通过鸡胚尿囊腔接种的方式生产，操作简单，易于大规模产业化生产，并且生产成本低。病毒活载体疫苗不需佐剂即可诱导机体产生比较广泛的免疫应答，包括体液免疫和较强的细胞免疫，甚至粘膜免疫，是目前及未来禽病疫苗研制与开发的主要方向之一[3]。

因此，本研究以NDV LaSota弱毒疫苗株为载体，构建表达TM 1基因的重组NDV，并在SPF雏鸡中进行免疫原性研究，探索其作为安全、有效和低成本的新型NDV和MG二联活疫苗的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 表达T7聚合酶重组痘病毒vTF7-3由NIH的Moss博士惠赠；MG H株由江苏省农业科学院兽医研究所提供；重组NDV弱毒疫苗株rLaSota、NDV感染克隆pBRN-FL-PmeⅠ以及辅助核蛋白（pBS-NP）、磷蛋白（pBS-P）和大聚合酶蛋白（pBS-L）重组质粒均由本实验室构建[4-5]；鸡抗NDV、鸡抗MG和鼠抗MG高免血清均由本研究室制备；SPF鸡胚和SPF雏鸡由本研究所SPF实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 T4 DNA连接酶及限制性内切酶均购自NEB公司；Prime Star HSDNA Polymerase购自TaKaRa公司；兔抗鸡IgG-FITC、山羊抗鼠IgG及羊抗鼠IgG-TIRTC购自Sigma公司；RNA提取试剂TRIzol、鼠源反转录酶（M-MLV）试剂盒以及磷酸钙转染试剂盒购自Invitrogen公司；DNA胶回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；鸡毒支原体ELISA检测试剂盒购自上海丽臣生物科技有限公司。

1.3 MG TM1基因的合成和序列分析 根据GenBank中登录的MG-TM 1基因的ORF序列（NC_004829.1）由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 表达TM 1基因的重组感染性克隆的构建 将合成的TM 1基因经PmeⅠ酶切处理后，回收TM 1片段，连接于同样经PmeⅠ酶切去磷酸化的NDV感染性克隆pBRN-FL-PmeⅠ中[5]，构建表达MG-TM 1基因的重组感染性克隆，pBRN-FL-TM 1（图1）。

图1 表达MG TM 1基因的重组型NDV基因组全长cDNA的构建Fig.1 Construction of genomic cDNA of recombinant NDV expressing MG TM 1

1.5 重组病毒的拯救 将MOI约为0.01表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3接种于90%的BHK-21细胞单层1 h后，利用磷酸钙转染试剂盒，将pBRN-FL-H及辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L分别以每孔 5μg、2.5μg、1.25μg、1.25μg共转染BHK-21细胞，具体拯救方法见参考文献[5]。收获血凝（HA）及血凝抑制（HI）检测均为阳性的尿囊液，并按常规方法接种于9～11日龄鸡胚，滴定每毫升病毒液的EID50。将拯救的重组病毒命名为rLa-TM 1。

1.6 重组病毒的RT-PCR鉴定 采用TRIzol法提取rLa-TM 1接种鸡胚尿囊液中的总RNA。以MGTM 1-F（5'-GCGAATTCATGAATAAGAAAAGAATCA TCTTAAAGAC-3'）和pBRN-8306-R（5'-GACTGCATT CACTGATGAG-3'）为引物，进行RT-PCR扩增[6]，对扩增的PCR产物进行测序分析。

1.7 TM1蛋白表达的激光共聚焦检测 分别将rLa-TM 1和rLaSota按MOI约为1.0感染BHK-21细胞，培养24 h后以3%多聚甲醛室温固定20 Min。以鼠抗MG高免血清（1∶50）和鸡抗NDV高免血清（1∶50）为一抗，山羊抗鼠 IgG-TIRTC（1∶200）和兔抗鸡IgG-FITC（1∶200）为二抗，对细胞进行DAPI细胞核染色处理。利用激光共聚焦显微镜进行检测。

1.8 重组病毒的致病性试验 按文献[7]的常规方法对重组病毒rLa-TM 1 F3代进行平均鸡胚致死时间（MDT）、脑内致死指数（ICPI）及静脉内致病指数（IVPI）等致病性指标测定。

1.9 重组病毒对鸡的免疫试验及抗体的测定 30只1周龄的SPF雏鸡，随机分为3组，将rLa-TM 1、rLaSota病毒液以106EID50的剂量分别以滴鼻点眼途径接种2组SPF雏鸡，第3组设为对照组。7 d后对雏鸡进行翅下静脉采血，并进行对NDV和MG特异的ELISA抗体检测试验。

免疫3周后，气管内注射MG菌（0.5×109cfu/0.5m L）进行攻毒。观察雏鸡呼吸道症状，记录雏鸡发病死亡情况。攻毒两周后，剖检观察免疫组和对照组鸡的气囊、气管、肺脏的病变情况。

2 结果

2.1 表达TM1基因的重组感染性克隆的构建和重组病毒的拯救 在NDV LaSota疫苗株反向遗传操作系统的基础上，利用PCR在MG-TM 1基因两端引入转录调控终止子（GE）、启动子（GS）序列和PmeⅠ酶切位点后，插入同样经PmeⅠ酶切处理的NDV感染性克隆pBRN-FL-PmeⅠ，构建获得表达TM 1基因的重组NDV cDNA克隆pBRN-FL-TM 1。

以pBRN-FL-TM 1与表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。收获细胞培养上清接种9～11日龄SPF鸡胚，继续培养5 d后，收获尿囊液进行HA和HI试验，结果显示均为阳性。

2.2 重组病毒的RT-PCR鉴定 提取具有血凝活性的病毒液RNA,利用RT-PCR方法扩增出1 960 bp的片段（图1），进一步的序列分析结果显示，重组病毒基因组的预期位点正确插入了MG-TM 1基因及所引入的转录调控序列。

图1 RT-PCR扩增重组病毒的MG-TM 1基因Fig.1 RT-PCR identification of recombinant virus of rLa-TM 1

2.3 TM 1蛋白表达的共聚焦检测 将rLa-TM 1、亲本株rLaSota分别感染BHK-21细胞，培养24 h后固定细胞，以鸡抗NDV高免血清和鼠抗MG高免血清为一抗，兔抗鸡IgG-FITC和山羊抗鼠IgGTIRTC为二抗，DAPI细胞核染色处理制备共聚焦样品。通过激光共聚焦观察到rLaSota感染的细胞内只有NDV蛋白表达；在rLa-TM 1感染的BHK-21细胞中存在NDV和MG两类蛋白，并且TM 1所表达的蛋白位于其细胞膜上（图2）。

图2 激光共聚焦观察MG-TM 1蛋白在重组病毒感染细胞内的表达Fig.2 Immunofluorescence analysis of rLa-TM 1 protein expression

2.4 重组病毒的致病性分析 重组病毒株rLa-TM 1 F3代的 EID50为 108.83/0.1 ML；MDT为 132 h，ICPI和IVPI均为0，属于温和或缓发型病毒株。该结果表明重组弱毒株保持了LaSota亲本疫苗株对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性。

2.5 重组病毒免疫鸡血清中MG抗体的检测 将rLaSota和rLa-TM 1分别接种一周龄SPF雏鸡。通过间接ElISA方法对所采集血样的抗体滴度进行检测。结果显示，rLaSota免疫组和空白对照组免疫后其体内均未检测到抗MG的抗体。而免疫rLa-TM 1组雏鸡在免疫后一周即可检测到显著的抗MG抗体，并逐渐升高，在3～4周达到一个平台期。免疫3周后进行攻毒，对照组的抗体略有升高。

2.6 重组病毒对SPF鸡的免疫攻毒保护试验 免疫3周后，对3组SPF鸡气管内进行MG攻毒，从第9 d开始非免疫对照组和rLaSota免疫组开始先后表现为精神不振，减食，流鼻涕，伸颈呼吸。而rLa-TM 1免疫组则未出现明显的临床症状。

攻毒2周后，对试验组和对照组进行剖检。免疫rLaSota组和对照组气囊明显增厚、浑浊，有黄色粘稠物，部分鸡喉头气管有淤血。rLa-TM 1免疫组气囊透、喉头及气管均无病变，保护率为90%（表 1）。

表1 攻毒后的发病率统计结果Table 1 The protection of chicks immunized w ith rLa-TM 1 against challenging w ith MG

3 讨 论

本研究利用反向遗传操作平台，将TM 1基因整合到LaSota弱毒疫苗株的基因中，构建重组病毒rLa-TM 1。将重组病毒感染BHK-21细胞，共聚焦法免疫荧光检测结果表明，大量TM 1编码的蛋白表达在细胞膜上。通过ELISA方法对免疫组和对照组血清进行检测，结果表明免疫组可产生较高水平的抗体。经MG强毒株进行攻毒保护试验，rLa-MG免疫组保护率可达到90%以上，而对照组则100%发病。实验结果证明NDV作为弱毒疫苗载体可以使表达的外源蛋白接近于天然状态，诱导更好的免疫保护反应。

郝永清等构建了TM 1基因真核表达质粒，通过肌肉注射途径免疫SPF雏鸡，然后经ELISA和流式细胞术对免疫鸡进行体液免疫和细胞免疫评估，结果表明所构建的真核表达重组质粒既可诱导机体产生体液免疫，也可以产生细胞免疫。攻毒试验证明，其免疫保护率达到79.5%[8]。由于生物安全性等方面的原因，目前基因疫苗在生产中还未能推广应用。在本研究中，构建的重组NDV接种鸡胚所收集尿囊液中的病毒滴度可高达每毫升109.5EID50以上。重组疫苗的MDT≥130 h，ICPI和IVPI均为0，保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应性和低致病性，具有很高的安全性。

由于MG培养条件苛刻，所以制造灭活苗和弱毒苗的成本较高。有时由于培养条件不良还可使MG某些免疫保护性抗原不能充分表达，造成灭活苗免疫不确实。另外，近年来研究表明MG的免疫机制以细胞免疫为主，而灭活苗诱导的免疫以体液免疫为主，所以灭活苗免疫往往无法达到预期效果。弱毒苗虽然既可诱导体液免疫也可诱导细胞免疫，但现行的弱毒苗的效力不够稳定，有时不能产生良好的免疫。本研究通过滴鼻点眼途径免疫鸡，证明NDV活载体疫苗能引起机体产生体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答。此外，NDV活载体疫苗可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射等多种方式给苗，使用极为方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低。该项研究为MG重组活病毒疫苗的进一步研究奠定了基础，有望成为防制NDV和MG感染更廉价、安全的新型重组基因工程活载体疫苗。

[1]牟建清，艾武，张秀美.鸡毒支原体感染的诊断与防治研究进展[J].山东农业科学，2000，4：54-55.

[2]Saito S,Fujisawa A,Ohkawa S,et al.Cloning and DNA sequence of a 29 kilodalton polypeptide gene of Mycoplasma gallisepticumas a possible protective antigen[J].Vaccine,1993,11（10）:1061-1066.

[3]温志远，葛金英，王永，等.水泡性口炎病毒印第安纳株反基因操作系统的建[J].中国预防兽医学报，2006，5：489-492.

[4]Ge Jin-ying,Bu Zhi-gao,Chen Hua-lan,et al.New castle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses[J].JVirol,2007,81:150-158.

[5]葛金英，温志远，步志高，等.表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46（4）：547-551.

[6]王永，葛金英，步志高，等.置换HN基因对新城疫病毒LaSota株致病力的影响[J].微生物学报，2008，48（5）：638-664.

[7]Office International des Epizooties.OIE manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals[M].Office International des Epizooties,Paris,France,2004.

[8]郝永清，王秀青，周艳君，等.鸡毒霉形体TM-1基因原核表达载体的构建及表达[J].中国兽医科学 2004，（04）：18-20.