可剪切聚乙二醇及TAT肽共修饰多柔比星脂质体的制备及表征Δ

朱亚勤，李玲，胡青，黄发珍，程亮，程丽芳，陈大为，2#（.苏州大学药学院，江苏苏州2523；2.沈阳药科大学，沈阳 006）

多柔比星（DOX）是临床常用的广谱抗肿瘤药物，但是它的毒副作用如骨髓抑制、心脏毒性等限制了其临床应用[1]。脂质体作为一种新型给药系统，具有不良反应小、无免疫原性和可生物降解等优点。将DOX包裹入脂质体可显著降低药物毒性，改善药物抗肿瘤效果[2]。

TAT肽是一种细胞穿膜肽[3]，其有效序列为AYGRKKRRQRRR，在生理pH下带正电荷。研究表明，TAT肽可显著提高脂质体、胶束等的细胞摄取[4]，增强化疗药物的抗肿瘤效果。然而，TAT肽无细胞选择性，直接与纳米载体相连后会降低纳米载体在体内的肿瘤靶向性。本研究将可剪切的聚乙二醇（PEG）5000连接在脂质体表面，TAT肽通过PEG2000连接隐藏在内层，构建可剪切PEG及TAT肽共修饰DOX脂质体（C-TAT-DOX-LP），并对其进行表征。

1 材料

RV10旋转蒸发仪（德国IKA公司）；Nicomp TM380ZLS粒径分析仪（美国Nicomp公司）；DeBEE高压微射流纳米均质机（美国Nano DeBEE公司）；SPD-M20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

盐酸DOX（原料药，北京华奉联博科技技术有限公司，批号：HF100622，纯度：＞99.5%）；二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（DSPE，上海艾伟特医药科技有限公司，批号：100929，纯度：≥99%）；大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司，批号：040403，纯度：96%）；胆固醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20101215，纯度：95%）；TAT-半胱氨酸（TAT-Cys，上海吉尔生化有限公司，批号：P120322-CQ289039，纯度：98%）；N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（NHS-PEG2000-Mal，北京键凯科技有限公司，批号：ZZ112P038，纯度：95%）；N-琥珀酰-3-2-联巯基吡啶-丙酸盐（SPDP，圣克鲁斯生物技术上海有限公司，批号：A1912，纯度：95%）；甲氧基-聚乙二醇 5000-巯基（CH3O-PEG5000-SH，上海炎怡生物有限公司，批号：B120628，纯度：≥95%）；二硫苏糖醇（DTT，上海前尘生物科技有限公司，批号：233155，纯度：≥99.5%）；透析袋（分子质量：8000～14000，上海源叶生物科技有限公司）；氯仿为分析纯，乙腈、三氟乙酸为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-二硫键-聚乙二醇5000（DSPE-S-S-PEG5000）的合成与表征

2.1.1 DSPE-S-S-PEG5000的合成。根据参考文献[5]，DSPES-S-PEG5000的合成步骤如下：称取20mg DSPE、8.2mg SPDP溶于无水氯仿中，加入适量三乙胺，N2保护，室温黑暗下搅拌反应5h。薄层色谱（TLC）监测反应进程。将80mg Ch3OPEG5000-SH溶解于氯仿反应液，继续反应12h，反应结束后，冷乙腈中沉淀除去未反应的DSPE。3000r/min离心5min，上清液旋转蒸发除去乙腈，加纯水置透析袋中透析48h，冻干。

2.1.2 DSPE-S-S-PEG5000的核磁氢谱（1H-NMR）表征。1HNMR（溶剂：氘代氯仿）表征，DSPE：δ 0.88（t，—CH3，6H），1.25（s，—CH2—，56H），PEG：3.65（s，—CH2—，456H），见图1。

图1 DSPE-S-S-PEG5000的1H-NMR图Fig 1 1H-NMR spectrum of DSPE-S-S-PEG5000

以上特征峰表明PEG5000成功连接到了DSPE上。以δ3.65与δ1.25处峰面积比计算产物纯度，结果产物纯度约为84.4%。

2.2 DSPE-PEG2000-TAT的合成与表征

2.2.1 DSPE-PEG2000-TAT的合成。根据参考文献[6]，DSPEPEG2000-TAT的合成方法如下：按物质的量之比1.2∶1称取DSPE、NHS-PEG2000-Mal溶于无水氯仿中，滴加5μl三乙胺，N2保护，室温反应5h。TLC监测反应进程。反应结束后，旋转蒸发除去氯仿，冷乙腈沉淀DSPE，上清液旋转蒸发除乙腈。产物透析48h，冷冻干燥。按物质的量之比1∶1.2称取DSPEPEG2000-Mal、TAT-Cys，溶于纯水，N2保护下，轻微搅拌。TLC监测反应进程。反应结束后置透析袋中透析48h，冷冻干燥。

2.2.2 DSPE-PEG2000-TAT的红外光谱（IR）表征。分别取适量TAT-Cys、DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG2000-TAT，加KBr压片，IR表征见图2。

图2 红外光谱图a.TAT-Cys；b.DSPE-PEG2000-Mal；c.DSPE-PEG2000-TATFig 2 FTIR spectrumsa.TAT-Cys；b.DSPE-PEG2000-Mal；c.DSPE-PEG2000-TAT

其中，a图中2556cm－1为TAT-Cys中巯基（—SH）的特征吸收峰，在c图中该吸收峰消失，b图中在此位置无吸收峰干扰，证明TAT肽中—SH与DSPE-PEG2000-Mal中的Mal基团已成功连接。b、c图中2920cm－1、2850cm－1为PEG中C—H伸缩振动，1104cm－1为PEG中C—O伸缩振动，a、c图中1664cm－1为TAT肽中酰胺键C—O伸缩振动，表明已成功合成DSPE-PEG2000-TAT。

2.3 TAT肽连接率的测定

2.3.1 TAT肽含量测定色谱条件。色谱柱：Promosil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A（乙腈+0.1%三氟乙酸）-B（水+0.1%三氟乙酸），梯度洗脱：0～12min，A：12%～37%，B：63%～88%，12～16min，A：37%～100%，B：0～63%；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；进样量：20μl。

2.3.2 方法学考察。依法进行精密度和回收率试验。结果低、中、高水平的日内精密度RSD分别为0.30%、0.67%、0.58%（n＝5），日间精密度RSD分别为1.56%、1.23%、1.31%（n＝5）；回收率分别为（98.68±0.23）% 、（99.49±0.21）%、（99.40±0.43）%，RSD分别为0.62%、0.71%、0.75%（n＝5）。

2.3.3 测定方法。反应前精密称取TAT-Cys，配制成100µg/ml的溶液，按“2.3.1”项色谱条件进样20µl，记录峰面积为A1；反应后取适量反应液稀释后按相同色谱条件进样，记录峰面积为A2，色谱见图3。

由图3可见，DSPE-PEG2000-Mal在此条件下对TAT肽无干扰。根据外标一点法计算未反应的TAT肽的量[＝（100×A2×稀释倍数×反应液体积）/A1]，进一步计算得到TAT肽的连接率[＝（反应前TAT肽的量－反应后TAT肽的量）/TAT肽理论反应量×100%]，经计算为96.3%。

2.4 脂质体的制备

图3 TAT肽的HPLC色谱图a.反应前TAT肽；b.反应后TAT肽；c.DSPE-PEG2000-MalFig 3 HPLC chromatograms of TAT peptidea.TAT peptide before reaction；b.TAT peptide after reaction；c.DSPEPEG2000-Mal

采用薄膜分散法及pH梯度法制备DOX脂质体（DOXLP），以后插入法[7]制备TAT肽修饰的DOX-LP（TAT-DOX-LP）、C-TAT-DOX-LP。方法如下：称取适量大豆卵磷脂、胆固醇溶于无水乙醇，旋转蒸发成膜。加入pH 4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，40℃水化20min。所得的脂质体进行超声粉碎（100W，400s），经高压微射流处理（20000psi，5min）后得空白脂质体（Blank-LP）溶液。取Blank-LP溶液适量，用0.1mol/L的Na2HPO4溶液调pH至7.6。按药脂比1∶15称取DOX溶于pH 7.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，将其缓慢滴加到Blank-LP溶液中，70℃温浴30min后，立即冷却，即得DOX-LP，未包封的DOX以透析法除去。取DSPE-S-S-PEG5000、DSPE-PEG2000-TAT各适量溶于pH 7.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中形成胶束溶液，按物质的量之比分别吸取适量胶束溶液滴入DOX-LP中，55℃条件下温浴1h，冷却后即得到C-TAT-DOX-LP，以同样方法制备TAT-DOX-LP。

2.5 粒径及Zeta电位的测定

取Blank-LP、DOX-LP、TAT-DOX-LP及C-TAT-DOX-LP各适量，蒸馏水稀释后用粒径分析仪测定粒径及电位。结果，所得脂质体粒径均在200nm以下，除TAT-DOX-LP带正电外，其他类型脂质体均带负电，见表1。

表1 不同脂质体粒径、电位、包封率测定结果（±s，n＝3）Tab 1 Particle size，Zeta-potential and encapsulation efficiency of different liposomes（±s，n＝3）

表1 不同脂质体粒径、电位、包封率测定结果（±s，n＝3）Tab 1 Particle size，Zeta-potential and encapsulation efficiency of different liposomes（±s，n＝3）

包封率，%093.5±0.892.1±1.391.8±1.5脂质体类型Blank-LP DOX-LP TAT-DOX-LP C-TAT-DOX-LP粒径，nm 108.2±2.4116.4±1.4122.1±2.3152.1±1.2Zeta电位，mV－8.6±0.5－14.4±0.78.4±0.4－5.4±0.3

2.6 透射电镜（TEM）形态观察

取DOX-LP及C-TAT-DOX-LP适量，滴加至专用铜网上，样品干燥后进行TEM扫描，结果见图4。

由此可见二者在形态上无明显差别，分布均匀且呈球形。

2.7 包封率的测定

2.7.1 色谱条件。色谱柱：Promosil C18（250mm×4.6mm，5µm）；流动相：水（含0.01mol/L磷酸二氢胺）-甲醇（35∶65）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：497nm；进样量：20µl。

2.7.2 方法学考察。依法进行精密度和回收率试验。结果低、中、高水平的日内精密度RSD分别为0.43%、0.41%、0.32%（n＝5），日间精密度RSD为0.62%、0.78%、0.58%（n＝5）；回收率分别为（98.75±0.52）%、（98.82±0.31）%、（100.04±0.52）%，RSD分别为0.52%、0.81%、0.63%（n＝5）。

图42 种脂质体的TEM图A.DOX-LP；B.C-TAT-DOX-LPFig 4 TEM micrograph of 2kinds of liposomesA.DOX-LP；B.C-TAT-DOX-LP

线性关系考察。标准溶液的制备：精密称取盐酸DOX适量，配成1.0mg/ml的母液，然后分别配成1、5、10、20、40μg/ml的溶液。按“2.7.1”项下色谱条件进样，以峰面积（A）对质量浓度（c）进行回归，得标准曲线方程A＝12129.4c－1064.5（r＝0.9998）。结果表明，DOX的检测质量浓度在1～40μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

2.7.3 包封率（Entrapment efficiency，EE）测定。采用超滤离心法测定脂质体的包封率。分别取“2.4”项下脂质体溶液各0.5ml，置于10KD超滤离心管中，12000r/min离心60min。将滤液适当稀释，过滤后取20μl进样，按“2.7.1”项下色谱条件测定外水相中游离药物的含量。按以下公式计算脂质体的包封率。包封率＝（投入的总药量－游离的药量）/投入的总药量×100%。结果所测脂质体的包封率均＞90%，见表1。

2.8 体外可剪切试验

取适量TAT-DOX-LP及C-TAT-DOX-LP，分别测定其粒径及电位；加入还原剂二硫苏糖醇（DTT，10mmol/L）后，同时在37℃水浴中孵育30min，再次测定二者粒径及电位[DTT（-）表示不加DTT，DTT（+）表示加DTT]，结果见表2。

表2 不同脂质体体外剪切后粒径及Zeta电位测定结果（±s，n＝3）Tab 2 Particle size and Zeta-potential of different liposomes after cleaved in vitr（ox ±s，n＝3）

表2 不同脂质体体外剪切后粒径及Zeta电位测定结果（±s，n＝3）Tab 2 Particle size and Zeta-potential of different liposomes after cleaved in vitr（ox ±s，n＝3）

脂质体类型TAT-DOX-LP C-TAT-DOX-LP粒径，nm DTT（-）120.8±2.3155.1±2.8DTT（+）122.1±1.2140.5±3.7Zeta电位，mV DTT（-）8.4±0.5－5.9±0.8DTT（+）8.1±0.37.8±0.6

孵育30min后，TAT-DOX-LP粒径及电位均无明显变化，说明DTT本身对粒径及电位无显著影响；而C-TAT-DOX-LP的粒径从155.1nm降低至140.5nm，电位由－5.9mV上升至7.8mV，证实了二硫键可在DTT作用下被还原断裂，暴露出TAT肽。

2.9 体外释放试验

分别取 C-TAT-DOX-LP、剪切后 C-TAT-DOX-LP（即TAT-DOX-LP）、盐酸DOX溶液各5ml（DOX质量浓度均为5mg/ml）于透析袋中，两端扎紧后，投入装有50ml pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）的三角瓶中，于（37±0.5）℃的恒温水平振荡，频率为100次/min。分别于 0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24、36、48h取样1ml，同时补充等体积的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液。收集样品按“2.7.1”项下色谱条件测定，计算累积释放度，绘制释放曲线，见图5。

图5 DOX、C-TAT-DOX-LP及TAT-DOX-LP的体外释放曲线Fig 5 Accumulative release curves of DOX，C-TAT-DOXLPand TAT-DOX-LPin vitro

由图5可见，游离DOX在8h时释放已达到90%，10h时几乎已释放完全；而C-TAT-DOX-LP及TAT-DOX-LP均释放缓慢持续，无突释点。对比2组脂质体，TAT-DOX-LP释放DOX有所增加，说明PEG被剪切后有利于DOX的释放。

3 讨论

本研究旨在制备C-TAT-DOX-LP。该脂质体外层的PEG5000可起到长循环作用，同时掩蔽TAT肽；在肿瘤组织的还原环境中，DSPE-S-S-PEG5000中的二硫键被还原断裂，暴露出内层的TAT肽，从而促进DOX-LP入胞，增强其抗肿瘤效果。合成部分，采用1H-NMR对DSPE-S-S-PEG5000进行表征，根据DSPE及PEG的特征质子峰鉴定其结构，并通过二者峰面积比计算其纯度；采用高效液相色谱法检测TAT肽连接率。结果表明，本研究所采用的合成方法简单易行且具有较高的反应效率。制备部分，采用经典的pH梯度法制备了高EE的DOX-LP，后插入法制备了C-TAT-DOX-LP。后插入法相较于传统方法简便、节省膜材且对EE无明显影响。体外试验用浓度为10mmol/L的DTT来模拟肿瘤组织的还原环境，通过测定C-TAT-DOX-LP粒径及电位的变化来考察其能否在肿瘤微环境下暴露TAT肽。结果显示，C-TAT-DOX-LP在DTT作用下电荷由负变正，与TAT-DOX-LP的电位较接近，证明C-TAT-DOX-LP能够暴露TAT肽，达到了试验设计的目的。体外释放试验表明，所制备的C-TAT-DOX-LP有明显缓释效果，PEG剪切后有利于DOX的释放。

综上所述，本研究成功制备了粒径均一、包封率高的CTAT-DOX-LP，为下一步考察其抗肿瘤效果奠定了基础。

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