崇仁麻鸡PepT1基因多态性与饲料转化率的关联分析

肖金华，武艳平 ，陆 伟，刘林秀，霍俊宏，季华员，康昭风，谢明贵，唐维国，何余湧，侯冠彧，谢金防

(1.江西省农业科学院 畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200;2.江西农业大学/江西省高等学校动物营养与饲料重点实验室，江西 南昌 330045;3.中国热带农业科学院 热带作物品质资源研究所，海南 儋州 571737)

崇仁麻鸡是江西省优良地方鸡种，蛋肉兼用型，肉嫩味美，营养丰富，具有显著的“三高一低”特点，即“可食部分高，人体必须的八种氨基酸含量高，维生素含量高，胆固醇含量低微。”从遗传角度来看，它是我国最宝贵的优质型青脚麻鸡遗传资源。但是崇仁麻鸡生长速度较慢，饲料转化率低，这严重的制约了它的发展。

小肽转运蛋白(PepT1)是一种主要针对二肽，三肽等小肽进行转运的跨膜蛋白，它对底物具有广泛的适应性[1]。目前，在动物体内已发现的小肽转运载体包括PepT1、PepT2、PTR3、大鼠的肽/组氨酸转运载体(PHT1)和人的肽/组氨酸转运载体(hPHT)[2]。其中研究最广泛的是PepT1和PepT2。PepT1主要是肠肽转运载体，它是一类低亲和力、高容量的肽载体;PepT2主要是肾脏肽转运载体，它是一类高亲和力、低容量的肽载体。1994年，Fei等[3]成功的克隆了寡肽的I型载体。小肽的转运是动物组织内一个重要的生理过程[4]。小肠对小肽(主要是一肽和二肽)的吸收是通过位于小肠上皮细胞刷状缘膜的H+耦合的肽转运载体(PepT1)进行的[5]，而质子是作为肽转运的驱动力发挥作用的[6]。与游离氨基酸吸收相比，小肽转运系统具有转运速度快、耗能低、不易饱和的特点[7]，而游离氨基酸吸收慢、载体易饱和、吸收时耗能高。Gilbert等[8]的研究发现PepT1基因在小肠的表达量与肉鸡的饲料转化率相关。王修启等[9]发现PepT1 mRNA表达受到发育阶段的调控。目前国内对PepT1基因的多态性在家禽中的研究尚未见相关报道。

鸡的PepT1主要在其肠道中表达，对蛋白营养吸收起着重要作，因此推断它与饲料转化效率有着一定的关系。本研究是以崇仁麻鸡为材料，对PepT1基因的第4外显子和第6外显子进行基因多态性研究，并对该基因与崇仁麻鸡饲料转化率的关联性进行分析。进一步深入研究该基因的变异性，有望发掘新的与饲料转化率相关的分子标记，进而将有效标记聚合到优质地方肉鸡品系育种中，以提高地方鸡饲料转化率。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本试验所用样本采自江西省崇仁县国品麻鸡有限公司，120日龄的崇仁麻鸡原种300只，其中公100只和母200只。每个鸡只翅静脉采血，肝素钠抗凝，置于冰盒，带回实验室，－20℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1 饲养管理 崇仁麻鸡60 d上笼，上笼前称取每只鸡质量，单笼单料槽饲养，自由饮水和采食，环境及营养水平一致，饲养全阶段由专人管理。饲养至120日龄分别对每只鸡进行称量，并称取剩余料量。

1.2.2 基因组DNA提取与检测 采用常规的饱和酚/氯仿抽提法，紫外分光光度法测定DNA纯度后，取部分样稀释至100 ng/mL，－20℃保存备用。

1.2.3 引物设计 根据GenBank发布的鸡PepT1基因序列(登录号为:AY029615.1)，采用Primer5.0分别对它的第4外显子和第6外显子设计两对引物，引物交由上海invitrogen公司合成。具体引物序列见表1。

表1 引物序列，产物大小及位置Tab.1 Primer sequence，corresponding PCR product size and position

1.2.4 PCR 扩增及产物检测 PCR 扩增体系总体积为 25 μL，其中包括 10 × Buffer 2.5 μL、dNTPs 1 μL、引物 1 μL、TaqDNA 聚合酶 0.4 μL、DNA 模板 1 μL，双蒸水 19.1 μL。扩增条件:95 ℃ 预变性5 min，94℃变性30 s，50～60℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，经33个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。引物不同，退火温度也略有差异。

PCR产物检测:将4 μL PCR产物与一定量的溴酚蓝上样缓冲液混合均匀，以1xTAE作为缓冲液，于20 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电压120 V，电泳时间30～40 min，紫外灯下检测扩增结果，BIORAD凝胶成像系统照胶，拍照保存。

1.2.5 测序 PCR产物经电泳鉴定后，用胶回收试剂盒(TIANGEN)回收目标片段、纯化后，交由上海

invitrogen服务有限公司DNA自动测序仪完成序列测定。

1.3 遗传学统计分析

统计不同基因型个体的数量，用POPGENE 32软件分析基因的多态信息，包括等位基因频率、基因型频率以及多态信息含量，用拟合优度检验来检验哈代－温伯格平衡，其相应的检验统计量为皮尔逊卡方统计量。用SPSS 17.0统计分析软件对不同基因型与饲料转化率进行单因素方差分析。考虑到样本均是来自同场同批次等情况，建立了以下固定效应统计模型。

Yij表示第j个试验鸡的性状值;u为总体均数;Gi表示第i个Pept1基因型效应;eij为第j个观察值的随机误差。结果用平均数加减标准差表示(Mean±SD)，当所统计的样本性状方差齐次时，处理间均值的多重比较用最小极差法(LSD)法，当所统计的样本性状方差不齐次时，处理间均值的多重比较用Tamhane检验法。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果

从鸡血样中提取的基因组DNA溶于100 μL TE中，用8 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明提取的基因组没有降解，长度在50 kb以上。OD260/OD280比值均介于1.7～1.8，提取的DNA符合生物学试验要求。

2.2 PCR 扩增结果

用设计的引物对试验鸡群的DNA进行扩增，PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段与目的片段大小一致，特异性良好，扩增产物没有非特异性条带和引物二聚体，结果可以用来进行直接测序(图1和图2)。

2.3 测序结果分析

本研究将PepT1基因引物PV1和PV2的PCR扩增产物进行纯化回收后送invitrogen公司进行测序，并用BioEdit 7.0软件将测序结果分别与GenBank中PepT1基因的序列进行了比对，确定SNP位点，并判断基因型，以期研究不同引物在崇仁麻鸡中的扩增片段突变情况。

2.3.1 PepT1基因引物PV1的测序结果图谱 将PV1测序结果和 GenBank的序列进行比对，如图3所示，PepT1基因PV1引物扩增的是第4外显子，在第4外显子的第95位上检测到有一处突变，由G→A。通过对所有鸡只序列碱基和峰图进行观察和分析，表现为3种基因型，即AA，AB和BB基因型。其中AA基因型的基因序列和GenBank中的一致，定义为野生型，AB基因型和BB基因型定义为突变型。

图1 PV1 PCR扩增产物电泳Fig.1 The electrophoresis photograph of PV1 PCR products

图2 PV2 PCR扩增产物电泳Fig.2 The electrophoresis photograph of PV2 PCR products

2.3.2 PepT1基因引物PV2的测序结果图谱 将PV2测序结果和GenBank的序列进行比对，如图4所示，PepT1基因PV2引物扩增的是第6外显子，在第6外显子检测到有两处突变，位于第6外显子的第64位和第70位，分别是由C→G和A→G。且这两个位点的变异具有同一性，当C→G的时候，A→G，当C不变时，A也不变。通过对所有鸡只序列碱基和峰图进行观察和分析，表现为两种基因型，即AA和AB基因型。未见到BB基因型，推测BB基因型可能是致死或致病基因，在自然选择中被淘汰。其中AA基因型的基因序列和GenBank中的一致，定义为野生型，AB基因型定义为突变型。

2.4 PepT1基因的遗传学分析

2.4.1 基因的多态分析 对测序结果进行基因型频率、等位基因频率和多态信息含量(PIC，polymorphism information content)的计算，并对其进行 Hardy－Weinberg平衡检验。基因型频率指一个群体中某一性状的各种基因型之间的相对比率，等位基因频率是指一个群体中某个基因对其等位基因的相对比率。用多态信息含量值(PIC，polymorphism information content)来衡量基因变异程度高低、反映遗传信息的多少[10]。多态信息含量是等位基因数和等位基因频率的变化函数。当位点PIC＞0.5时，该位点为高度多态位点;当位点0.25＜PIC＜0.5时为中度多态;当PIC＜0.25时为低度多态位点。由表2可知，在崇仁麻鸡中PepT1基因PV1位点存在三种基因型(AA、AB、BB)，AB基因型最高，比率为0.504 7。而在PV2位点存在两种基因型(AA、AB)，等位基因A占绝对优势，不存在BB基因型，其中AA基因型频率显著高于AB基因型。同样由表2可得到，PV1位点在崇仁麻鸡上表现为中度多态，PV2位点为低度多态位点。

2.4.2 基因的Hardy-Weinberg平衡检验 哈代－温伯格定律也称为遗传平衡定律，实际观测值与理论推断值之间的偏离程度就决定了卡方值的大小。卡方值越大，偏差就越大，就越不符合Hardy-Weinberg平衡，相反，若卡方值越小，偏差就越小，就越是符合Hardy-Weinberg平衡，当卡方值为0时，则说明理论值和实际观测值完全相等。卡方适合性检验结果表明，PV1和PV2位点在崇仁麻鸡上均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)，说明崇仁麻鸡群体性状性比较稳定，该品种仍具有较大的选育潜力。

图3 PV1的SNP序列分析Fig.3 Sequence analysis on the isolated genotype of PV1

图4 PV2的SNP序列分析Fig.4 Sequence analysis on the isolated genotype of PV2

表2 PepT1基因、基因型频率、PIC及Hardy-Weinberg平衡检验Tab.2 Distribution of PepT1 genotype，allele frequency ，PIC and Hardy-Weinberg test

2.5 PepT1基因不同基因型与崇仁麻鸡饲料转化效率的相关性分析

对崇仁麻鸡PepT1基因各SNPs基因型与饲料转化效率进行最小二乘分析，不同基因型各饲料转化效率的均值和标准误比较结果如表3所示，由表3可知，PepT1基因PV1位点的三种基因型和PV2位点的两种基因型与崇仁麻鸡饲料转化效率均没有显著相关性(P＞0.05)。

表3 不同基因型对崇仁麻鸡饲料转化率的影响Tab.3 Effect of different genotypes on Feed conversion rate of Chongren spotty Chicken

3 讨论

蛋白质吸收代谢机制一直是动物营养研究的重点，传统蛋白质理论认为蛋白质只有被降解成游离氨基酸才能够被机体吸收代谢。直到当Ⅰ型小肽体(PepT1)在肠道被成功克隆后，小肽能被小肠吸收的观点才逐渐被广泛地接受。但国内外报道对PepT1的研究几乎都基于对其mRNA差异性比较以及对其机制的阐述和影响其活性调控的因素上，对于PepT1基因多态性的研究却鲜见报道。此外，因测定饲料转化效率难度大、成本高，对于饲料转化率的研究也还较少，尤其对于饲料转化率与小肽转运蛋白基因遗传关系的相关研究十分罕见。国内外研究者对饲料转化率这一性状，大多都是在营养水平上进行研究，有关家禽中饲料转化效率遗传参数的研究较少，有研究认为在纯种与杂种蛋鸡研究中，饲料利用率和采食量为中等遗传力，体质量遗传力较高，饲料利用率与体质量有高的正遗传相关[11]。

本研究采用PCR产物测序的方法分析崇仁麻鸡的PepT1基因，试图检测PepT1基因的单核苷酸多态性，并对其突变位点与崇仁麻鸡饲料转化率进行相关性分析。分别对其第4外显子和第6外显子区域设计了两对引物PV1和PV2，其中引物PV1扩增第4外显子，引物PV2扩增第6外显子。测序分析结果共发现了3个SNPs位点，均为沉默突变，不改变所编码的氨基酸，其中第4外显子上1个，即在第4外显子的第95位上检测到有一处突变，由G→A，发生了碱基之间的转换;第6外显子上2个，位于第6外显子的第64位和第70位，分别是由C→G和A→G，发生了碱基之间的颠换和转换。

目前，定位数量性状位点的方法主要有基因组扫描和候选基因法，其中候选基因法应用较多[12－13]。在候选基因法中，只要发现候选基因位点上存在多态性，便可直接研究此多态性与目标性状间的联系。基因多态性的研究是确定某种特定基因对家禽经济性状是否有显著影响的一种较为成熟的方法。Zhang等[14]研究了鸡载脂蛋白B基因多态性和鸡体质量和腹脂的关联分析;Cui等[15]报道了鸡催乳素基因启动子区的多态性对鸡产蛋性状的影响。张世卿、卢亚萍等[16－17]的研究发现溶菌酶对鸡的生长发育有显著影响。Nagaraja等[18]对白来航鸡IGF－1基因5'端扩增产物进行PstI消化后，所得基因型除了与蛋及蛋壳重有关外，与体质量、摄食量和产蛋率等性状没有关系。Amills等[19]对鸡IGF－1基因5'侧翼区分析，发现存在A/C突变，并报道突变与鸡的生长和采食呈显著相关。本研究分析了崇仁麻鸡的PepT1基因的第4外显子和第6外显子序列，其中在第4外显子上发现在了3种基因型，在第6外显子上只发现2种基因型，缺少BB基因型，推测BB基因型可能是致病或致死基因型，从而在自然选择中被淘汰。通过SPSS17.0软件将基因型与饲料转化率进行相关分析，发现这3个SNP位点所产生的各基因型与饲料转化率之间均差异不显著(P＞0.05)，造成差异不显著的原因可能是样本量太少，还有所选样本只是根据表型选择，还未进行专门化品系选育，也有可能是PepT1基因的这3个多态位点与饲料转化率就没有关联。因此笔者下一步的试验会针对饲料转化效率对崇仁麻鸡进行选育，将PepT1基因作为与崇仁麻鸡饲料转化率相关的候选基因进行深入的研究，探讨PepT1基因在崇仁麻鸡小肠各段的表达差异和不同饲料转化率在同一肠段的表达丰度差异。通过基因和性状的关联分析，希望能找到能够影响饲料转化效率的主效基因或控制这些性状的主效基因连锁，为家禽的生产和选育提供理论依据。

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