耐亚胺培南鲍曼不动杆菌苯唑西林基因型分析

雷 红，董 梅，刘 敏，孙敏霞，孟祥红，佟爱华，刘 昕

解放军第309医院 检验科，北京 100091

碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的重要机制之一。鲍曼不动杆菌产生的碳青霉烯酶主要包括两大类酶，即D类苯唑西林(oxacillin，OXA)酶和B类金属β-内酰胺酶[1-2]。其中OXA型碳青霉烯酶是引起世界范围内鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的最重要原因[3]。OXA型碳青霉烯酶是能水解苯唑西林的β-内酰胺酶，属于Ambler分子分类中的D类酶，该类酶可以水解青霉素类、头孢菌素、碳青霉烯类和氨曲南等抗菌药物，导致产酶细菌对这些抗菌药物耐药[4]。本文研究耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的碳青霉烯酶基因型，对临床合理应用抗菌药物和医院感染监控提供科学依据。

材料和方法

1 菌株来源 收集解放军第309医院2010年4-12月住院患者的非重复耐亚胺培南鲍曼不动杆菌68株，分离菌株均使用甘油肉汤菌种保留管-20℃保存备用。

2 主要仪器和试剂 PCR扩增仪(Bio-Rad)，电泳仪(北京六一仪器厂)，LB肉汤，琼脂糖(Biowest，西班牙)，ExTaq DNA聚合酶等。

3 多重PCR引物 所用PCR引物均由生物工程(上海)有限公司合成，各引物序列见表1。多重PCR扩增体系及程序见表2。

多重PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性 25 s，52℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，30 个循环；72℃再延伸6 min。同时以无菌水为阴性对照。

4 DNA模板制备 挑取单个菌落转接至LB肉汤中，37℃恒温振荡培养8 h。取2.0 ml菌液，采用加热煮沸方法制备DNA模板。制备好的模板置于-20℃冻存。

5 PCR产物测序及序列比对 将OXA-23和唯一1株OXA-58阳性菌株，采用PCR检测，扩增产物由北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序，并采用DNASTAR软件把测序结果与Genbank进行比对。

表1 多重PCR引物序列及预计PCR产物片段长度Tab.1 Primers used in PCR and length of PCR product fragments

表2 50μl多重PCR反应体系Tab.2 PCR amplification in 50μl

结 果

1 多重PCR扩增OXA基因 共扩增68株临床分离的耐亚胺培南鲍曼不动杆菌，7株菌只携带OXA-51基因(检出率为10.29%)，60株菌同时携带OXA-51和OXA-23基因(检出率为88.24%)，仅有1株菌株同时携带OXA-51和OXA-58基因(检出率为1.47%)，未扩增到OXA-24基因，见图1。

2 OXA-23基因测序和比对 对PCR纯化产物进行测序，在Genbank经Blast比对发现该基因片段与序列号JQ002680.1基因片段的blaOXA-23基因序列的同源性均达99%，表明菌株中blaOXA-23基因是高度保守。

3 OXA-58基因测序和比对 对PCR纯化产物进行测序，在Genbank经Blast比对发现该基因片段与序列号HQ219687.1基因片段的blaOXA-58基因序列同源性达99%。

图1 多重PCR检测68株鲍曼不动杆菌OXA基因电泳图第3和第16号株仅具有OXA-51基因，其余14株均同时具有OXA-51和OXA-23基因Fig.1 PCR showing electrophoresis for OXA genes in 68 imipenemresistant Acinetobacter baumannii strains OXA-51 gene in No.3 and 16 strains and OXA-51 and OXA-23 genes in No.14 strain

讨 论

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制是该菌产D类碳青霉烯酶[5-6]。D类碳青霉烯酶(OXA型)属丝氨酸蛋白酶，通常水解苯唑西林、甲氧西林等。1993年Paton等报道世界上第1例鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶活性的β-内酰胺酶，并命名为ARI-1，该菌可水解亚胺培南，水解活性不被克拉维酸和EDTA所抑制。该菌株来源于1985年苏格兰爱丁堡皇家医院1例病人的多重耐药鲍曼不动杆菌分离物。直到2000年，Donald等[7]对ARI-1酶的氨基酸序列进行分析，将ARI-1重新命名为OXA-23。从此，在世界范围内相继报道耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌携带有OXA基因。根据氨基酸序列的同源性分类，D类酶分为9个亚组[8-9]，第1亚组包括OXA-23、OXA-27和 OXA-49； 第 2亚 组 OXA-24、OXA-25、OXA-26、OXA-40和OXA-72；第3亚 群 由OXA-51、OXA-64——OXA-71、OXA-75——OXA-78、OXA-83、OXA-84、OXA-86——OXA-89、OXA-91、OXA-92、OXA-94 和OXA-95组成，第4亚组仅具有OXA-58；第5亚组为染色体编码酶OXA-55和OXA-SHE组成；第6亚组由OXA-48、OXA-54；第7亚组由OXA-50家族组成，包括OXA-50a——OXA-50d；第8亚组包括 OXA-60家 族 (OXA-60a——OXA-60d)；第 9亚 组为OXA-62。然而经临床研究发现9亚组D类酶中，临床分离鲍曼不动杆菌主要包括前4个亚组，其 代 表 酶 分 别 为 OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58型。

本文通过研究前4个亚组OXA基因发现，在68株分离于临床患者的耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中，全部携带OXA-51基因(检出率为100.0%)，只携带OXA-51基因有7株(检出率约为10.29%)；同时携带OXA-51和OXA-23基因有60株(检出率约为88.24%)；只有1菌株同时携带OXA-51和OXA-58基因(检出率约为1.47%)；未扩增到OXA-24基因。本研究结果表明解放军第309医院耐亚胺培南鲍曼不动杆菌携带OXA基因以OXA-51+OXA-23基因为主。此结果不仅与Woodford等[10]报道相一致，也与国内大多数文献报道相一致[2,11-13]，其中王辉报道1999-2002年北京、广州两地对亚胺培南耐药的不动杆菌研究，绝大多数菌株产OXA-23型碳青霉烯酶；沈定霞报道绝大多数鲍曼不动杆菌含有OXA-23型碳青霉烯酶。由此说明中国大多数地区耐亚胺培南鲍曼不动杆菌以产OXA-51+OXA-23型碳青霉烯酶菌株为主要的流行株。OXA-58首次发现于2003年法国图卢兹分离的碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌，该酶可水解青霉素、苯唑西林和亚胺培南，但不水解超广谱β-内酰胺类抗菌药物。OXA-24基因位于染色体上，只能发生垂直传播，即亲代传递给子代，可以水解亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗菌药物，但对苯唑西林的水解能力较弱或者不水解。本次研究未检测到OXA-24基因，与国内报道相一致[2,11]。因为对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌具有不同的OXA耐药基因型，那么携带不同的OXA耐药基因型的鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药水平是否不同，有待进一步研究。

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3 汤凤珍，张伟红，陈惠玲．碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因型研究［J］.中国感染与化疗杂志，2010，10（5）：354-356．

4 王辉，陈民钧．碳青霉烯酶：未来困扰我们的难题［J］.中华内科杂志，2003，42（5）：354-356．

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11 张伟红，叶惠芬，杨银梅，等．耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药表型和碳青霉烯酶基因型分析［J］.中国感染与化疗杂志，2011，11（1）：45-48．

12 杨培洪，凌保东．耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌OXA酶基因研究［J］.中国抗生素杂志，2011，36（9）：703-707．

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