心之络病“孙络绌急”模型大鼠心肌组织病理变化研究

霍旺 杨明会 李绍旦 王朋

“脉络—血管系统病”［1］理论认为，脉络与中小血管以及微循环具有密切相关性，孙络作为脉络分支的最末端结构与微血管相对应。孙络系统功能正常对于保障机体微循环内环境稳态，维持机体正常生理功能具有极其重要的意义。“孙络绌急”为孙络一过性或持续性收缩、挛急状态，是孙络主要的病理变化之一，与微血管痉挛基本类似［2］。当前越来越多的研究证实，心之病络“孙络绌急”作为多种缺血性心脏病的共同病理基础，参与着各种心系疾病的病理发展过程［3］。因此阐明“孙络绌急”的微观病理变化特征对于中医理论指导临床多种心系疾病的防治具有重要意义。本研究通过建立大鼠“孙络绌急”模型，采用心肌组织HE染色、Nagar-Olsen特殊染色及透射电镜等技术手段，从组织形态学、超微结构等方面探讨心之络病“孙络绌急”模型下心肌组织病理变化特征，为心之病络中医辨证论治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠30只，体重(220±20)g，购自军事医学科学院动物中心，动物许可证号:SCXK-(军)2007-004。按6只/笼饲养于独立通气笼具系统内。温度:(22±1)℃，湿度(50±5)%，每天光照与黑夜时间各12小时。实验期间造模、取材等操作均在超净工作台内进行，添加饲料、换水等由专人负责管理。

1.2 主要药物与试剂

垂体后叶素(pituitrin，pit)注射液(南京新百药业有限公司生产，批号:111204);乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，批号:T20111110);4%多聚甲醛(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号:AR-0211);50%戊二醛(国药集团化学试剂有限公司，批号:20111215)。

1.3 主要仪器

动物心电图机(FX-211，北京福田电子医疗仪器);光学显微镜(CH-2，日本Olympus公司);多功能显微镜带相机(FDX-35，日本Nikon公司 );透射电子显微镜(H-7650，日本日立公司);超薄切片机(UCT，德国莱卡公司)。

1.4 造模及分组处理

“孙络绌急”大鼠模型参照文献予股静脉注射pit方法进行复制［4］，心电图标准Ⅱ导联ST段抬高＞0.1 mV说明造模成功。30只大鼠按照随机数字表法随机分成正常组和造模5分钟组、10分钟组、20分钟组、30分钟组5组，每组各6只。各组大鼠20%乌拉坦按5 ml/kg剂量腹腔注射麻醉，麻醉后仰位固定于鼠台，由四肢皮下插入电极针连接动物心电图机。大鼠腹股沟处常规消毒，钝性分离股静脉，各模型组股静脉注射pit 6 U/kg(5秒内匀速注射完毕)，正常组注射等量生理盐水。

1.5 标本处理与观察

1.5.1 HE染色 各组大鼠摘取心脏，冰浴下取左心室前壁心尖组织，至于4%多聚甲醛中固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制备石蜡切片，超薄切片机切片，切片厚度5μm。形常规HE染色:石蜡切片常规脱蜡水化，苏木素液染色，1%盐酸乙醇分化，反蓝，乙醇伊红染色，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察组织结构并拍照。

1.5.2 Naga-Olsen染色 心肌组织石蜡切片常规脱蜡水化，苏木精染色1分钟，清水洗涤，蒸馏水漂洗，碱性复红液染色3分钟，丙酮苦味酸溶液分化，丙酮脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察［5］。

1.5.3 电镜 各组大鼠冰浴下取左室心尖部心肌组织各2块，每块体积1 mm ×1 mm ×2 mm，将组织块固定于2.5%戊二醛中2小时，经磷酸缓冲液冲洗后，1%锇酸后固定1小时，经丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，片厚约70 nm，先后经枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色，透射电镜下观察。

2 结果

2.1 HE染色

光学显微镜下显示，各模型组心肌细胞胞质、胞核显示清楚，细胞膜完整界限清楚，心肌肌原纤维可见，未见变性和坏死。心肌细胞间毛细血管管腔内有红细胞，心内膜平滑。未见炎性细胞。各组间心肌均未见明显缺血性病理改变，见图1。

2.2 Naga-Olsen染色

切片经Nagar-Olsen染色后，光学显微镜下可见正常心肌组织染成黄色，而缺血心肌组织可见红染的阳性反应区。与正常组比较，各模型组均可见到大片红染的阳性反应区域，且尤以10、20分钟时阳性反应最为明显，见图2。

2.3 电子显微镜

透射电子显微镜下，正常组线粒体膜完整，形态规则，线粒体嵴丰富，排列整齐;模型5分钟组线粒体明显肿胀，线粒体嵴稀疏并有少量空泡性变;模型10分钟组线粒体嵴排列紊乱、断裂消失甚至呈空泡性变;模型20分钟组及30分钟组可见大部分线粒体嵴断裂消失呈空泡性变，见图3。正常组心肌细胞可见核膜完整，染色质分布均匀，各模型组电镜下可见心肌细胞核不规则，染色质边集，心肌细胞凋亡现象明显，见图4。正常组微血管内皮细胞形态完整，细胞核膜完整，染色质分布均匀。各模型组微血管内皮细胞核不规则，染色质不均匀、边集，凋亡现象明显，吞饮小泡数量显著增加，见图5。

3 讨论

“孙络绌急”是在络病学理论基础上提出的新概念。“绌”有屈曲紧急之意，“急”即拘急，“绌急”则意为屈曲拘急，有痉挛之意［6］。既往研究基于血脉与血管在解剖形态学上的同一性，提出了“脉络—血管系统病”［1］理论，微血管属于血脉分支脉络末端之孙络，从血脉分之而出逐层细分遍布全身的“孙络—微血管”发挥着渗灌气血、濡养代谢、津血互换的生理功能。因此微血管病变导致器官组织功能、结构的病理改变与孙络受损进而导致孙络病的病理变化具有密切相关性。“脉络—血管系统病”和“络病学说”的提出为微血管病变的中医辨证论治提供了理论依据。有学者在既往研究中通过对“络脉绌急”相关实验研究提出了中医络脉绌急与现代医学冠状动脉痉挛、血管内皮功能紊乱之间的密切相关性［7］，这一理论对于指导冠状动脉微血管痉挛的中医辨证研究奠定了坚实的基础。

本研究采用股静脉注射垂体后叶素方法建立心之络病“孙络绌急”大鼠模型，并通过观察心肌组织形态及超微结构变化，以探讨心之络病“孙络绌急”模型下心肌组织超微结构变化特征。本研究结果显示，各模型组心肌组织HE染色并未见因绌急导致的明显病理改变，而采用Nagar-Olsen特殊染色处理后在各模型组则均可见到大片阳性反应区，提示“孙络绌急”在较短时间内即可引起心肌组织明显缺血，并且其缺血程度尤以造模10分钟、20分钟组最为明显。两种染色方法结果的差异性究其原因主要与其染色原理有关，HE染色主要基于细胞内酸碱关系的明显变化或细胞内坏死物质的积聚，而这些病理改变一般发生在细胞死亡后的6至12小时［8］，因此在短时间内并不能看到明显病理改变。而Nagar-Olsen特殊染色主要基于心肌早期缺血改变与正常心肌对某些色素的着色性质不同而呈现不同的色调，因而可以显示和判定心肌早期缺血的变化［9］。此结果提示，与HE染色相比Nagar-Olsen特殊染色对早期心肌缺血更为敏感，可作为早期心肌缺血损伤的检测手段。

心肌细胞超微结构的改变是反映细胞损伤最直观的指标。线粒体是维持细胞能量的功能单位，对缺血缺氧最为敏感，是反应心肌细胞损伤的敏感指标［9］。本研究结果显示，投射电镜下各模型组可见线粒体嵴明显稀疏、模糊断裂，甚至出现空泡性变，并且各模型组心肌细胞核不规则，染色质边集，心肌细胞凋亡现象明显，此结果提示“孙络绌急”导致的缺血缺氧在较短时间内即可引起心肌细胞明显受损。生理状态下，微血管内皮细胞对于维持血液正常流态、调节微血管张力以及血管内外营养物质交换等方面具有极其重要意义［11］，其结构的完整性是生理功能得以发挥的重要基础。本研究结果显示，各模型组均可见微血管内皮细胞细胞核不规则，染色质不均匀、边集，细胞结构遭到破坏，凋亡现象明显。提示“孙络绌急”可加剧微血管内皮细胞凋亡，引起微血管内皮细胞结构破坏，从而导致其正常生理功能发生紊乱。此外，各模型组微血管内皮细胞内吞饮小泡数量显著增加，亦提示“孙络绌急”模型下微血管内皮细胞可能通过增加吞饮小泡数量的方式引起微血管内皮细胞通透性改变，从而发挥相应的病理生理作用。

［1］吴以岭.“脉络-血管系统病”新概念及其治疗探讨［J］.疑难病杂志，2005，4(5):285-287.

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