大黄酸对糖尿病肾病大鼠足突细胞nephrin基因表达的影响

陈建伟，刘 玲，钟 玲

（重庆医科大学附属第二医院肾内科 400010）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病严重的常见微血管并发症，是最终导致终末期肾衰竭的常见原因，也是糖尿病致死的主要原因之一，由于其发病率高，治疗棘手、效果差，危害大而备受关注。而近年来研究发现nephrin基因在足突细胞上的表达下调在肾功能不断恶化中起到重要作用［1］。因此，如何抑制nephrin基因在足突细胞上的下调，在DN的治疗中起到至关重要的作用，目前为止很多临床对照研究显示，大黄酸在控制DN蛋白尿及DN进展中有一定作用，然而，其除了对血糖、胰岛素抵抗、减轻肾脏肥大等作用之外［2－3］，是否能够抑制nephrin基因下调，目前尚无实验研究。本实验旨在探索大黄酸对DN的治疗作用，以及通过nephrin基因在DN大鼠足突细胞的表达变化，探讨大黄酸治疗DN的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar雄性大鼠18只，体质量170～200g（重庆医科大学中心实验室）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）［3－4］。

1.2 试剂 24h尿蛋白测定试剂盒（北京为康惠华生物公司）；酶联免疫吸附测试大鼠尿微量清蛋白试剂盒（上海研谨生物科技有限公司）；抗体稀释液（ADI公司）；兔抗nephrin抗体。

1.3 实验药物 大黄酸是从大黄的根茎中提取［5－6］，大黄根茎购自北京兴事堂，并由上海众华生物科技有限公司提取。

1.4 仪器 德国Satorious电子天平；日立7020生物分析仪。

1.5 方法

1.5.1 动物模型制作 按照Anderson等［1］建立方法将所有动物适应性喂养5d，禁食12h，STZ以0.1mmol／L柠檬酸缓冲液溶解，按照50mg／kg一次性腹腔注射作为DN模型，模型对照组给予同等剂量的柠檬酸缓冲液，72h后开始检测空腹血糖、尿糖、尿量及24h微量清蛋白排泄率，DN建立成功标准为：（1）空腹血糖高于16.6mmol／L；（2）尿糖强阳性；（3）尿量／原尿量大于1.5；（4）24h尿蛋白排泄率大于30mg／24h。

1.5.2 实验分组 将DN动物模型分为2组：模型组、大黄酸治疗组。大黄酸溶于生理盐水，灌胃给药，每天1次，大黄酸治疗组给予大黄酸150mg·kg－1·d－1干预8周（n＝6），模型组及模型对照组分别给予等剂量生理盐水灌服作为对照（n＝6）。实验重复2次。

1.5.3 血糖、体质量、肾功能的测量 每2周测量各组大鼠血糖1次；第8周测定各组大鼠体质量；股动脉放血20μL分离血清，使用日立7170A全自动生化分析仪（重庆医科大学中心实验室）测量血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、血清总胆固醇（TC）及三酰甘油（TG）。

1.5.4 尿微量清蛋白排泄率的检测 给药6周后，大鼠放入代谢笼，留取24h尿液，计算尿量，尿液离心25min（4℃，4 000r／min），取上清液分装，并于－70℃冻存，后使用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测尿蛋白。

1.5.5 肾组织形态学观察 大体观察并称质量。光镜下观察：在给予大鼠大黄酸干预8周后，麻醉并经腹主动脉插管，5℃磷酸盐缓冲液（PBS）灌注后取肾脏。迅速剥去肾包膜，称重后纵向剖开肾脏，切取约0.5cm×0.5cm×0.2cm大小的肾脏组织，肾组织经过10%中性甲醛缓冲溶液中固定、浸蜡、包埋、切片，HE、PAS、Masson3染色观察，取1mm×1mm×1 mm肾皮质，经戊二醛固定、饿酸后固定、脱水、环氧树脂618包埋，制作成超薄切片，用醋酸铀－柠檬酸铅染色，JEM透射电镜下观察。

1.5.6 肾脏免疫组织化学检测 5μm肾组织石蜡切片梯度脱蜡水化后，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，0.01mol／L PBS缓冲液洗涤，正常兔血清封闭，一次加入nephrin抗体，DAB显色，苏木精复染，树脂封片，采用JD－801计算机图像分析系统，每张切片随机选取15个肾小球，计算各组肾小球内nephrin的阳性信号占肾小球面积百分比［4］。

1.5.7 肾小球足突细胞密度测定 10%中性甲醛缓冲溶液固定，常规脱水、浸蜡、包埋、5μm石蜡切片。兔抗大鼠 WT1多克隆抗体（Merk公司）免疫组化SP法检测肾小球WT1表达，Image－Pro Plus 6.0彩色图像分析系统半定量足突细胞密度。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以表示，两组间比较进行t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 模型组血糖均有升高，与模型对照组比较，均有多尿、多饮、多食、消瘦等症状。模型制作成功后，模型组血糖较模型对照组血糖升高明显（P＜0.05），除模型对照组外，其余两组间血糖差异无统计学意义（P＜0.05）。DN大鼠体质量均低于模型对照组（P＜0.05）。

2.2 各组指标比较 模型组大鼠24h尿蛋白定量均高于模型对照组（P＜0.05），见图1。6周后大黄酸治疗组与模型组比较，除血糖无明显变化外，BUN，Cr显著改善（P＜0.05），见表1。

图1 各组24h尿蛋白量

2.3 肾组织形态学改变 模型组肾脏较模型对照组肾脏外观苍白、肿胀，质地变硬。模型对照组大鼠肾小球、肾小管形态规则，无明显细膜基质增生。模型组肾小球肥大，见系膜区弥漫性增宽，并有逐渐增多的PAS阳性物质沉积，肾小球基底膜（GBM）增厚，近端肾小管上皮细胞含较多糖原，并呈空泡样及颗粒样变性，间质内较多淋巴细胞等炎性细胞浸润。大黄酸干预后，肾小球及肾小管病变均有不同程度改变。见图2。

表1 各组生化数据变化比较

表1 各组生化数据变化比较

组别 n 体质量（g） 肾质量（g） 血糖（mmol／L） BUN（mmol／L） Cr（μmol／L） TC（mmol／L） TG（mmol／L）模型对照组 6 412.1±13.1 2.07±0.12 5.10±0.11 5.90±0.68 71.2±0.58 1.10±0.10 0.50±0.35模型组 6 210.3±8.41 5.31±1.57 26.12±7.89 19.12±4.32 124.1±2.87 2.79±0.21 2.63±0.20大黄酸治疗组 6 256.3±5.12 2.53±0.20 24.03±1.24 11.21±4.27 87.9±1.87 1.74±0.19 7.81±0.21

图2 模型组肾小球病理改变电镜下图片（免疫组化，×1 000）

2.4 足突细胞上nephrin的表达 nephrin特异性的表达于肾小球足突细胞上，通过电镜观察，模型组足突细胞上nephrin阳性明显，大黄酸治疗组阳性明显减少，半定量分析见：大黄酸治疗组与模型组比较，肾小球nephrin阳性面积百分比差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 各组足突细胞nephrin表达

3 讨 论

研究发现，DN在早起正确治疗，可能逆转肾小球、肾小管病理改变，但是，一旦进入Ⅳ期，病理改变就难以逆转，因此，在DN的治疗中应该早起诊断及治疗，既往研究发现，GBM成分改变及细胞外基质聚集是最终导致DN的关键病理改变，然而这些研究并不能完全解释蛋白尿及肾小球滤过率的改变，而近期研究发现足突细胞的损伤在DN的发病中起了重要作用，而nephrin基因表达的nephrin蛋白在足突细胞的裂孔隔膜中起重要作用，是裂空隔膜的主要成分［7－9］。本实验研究大黄酸在早期使用，对足突细胞裂空隔膜的主要成分nephrin基因表达的影响。

目前，国内外大部分研究，都是针对肾脏血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）升高的研究，研究认为高血糖等作用最终导致AngⅡ升高，使机体血流动力学的改变，从而让肾脏处于高压力、高滤过、高灌注的病理情况下，最终导致肾脏损伤［10］。今年研究发现，使用血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）、血管紧张素受体（accounting Research Bulletins，ARB）等药物阻断AngⅡ或者AT1发挥生物学效应。而针对足突细胞及nephrin基因的研究较少，足突细胞即肾足突细胞，小囊脏层上皮细胞，它附着于GBM的外侧，是一种高度分化和特异性的细胞，呈星状多突状，主要由3部分组成：细胞体、主突、足突，足突呈指状交叉覆盖于GBM外侧，并通过黏附分子及糖蛋白分子将二者相连，足突细胞之间由极薄的裂空隔膜相连接，构成一种拉链式结构，从而与GBM及肾小球内皮细胞共同构成肾小球滤过屏障，是具有电荷及相对分子质量选择性的分子筛［11－12］。正常情况下，这种电荷屏障及机械屏障能保持肾脏正常的滤过功能，然而在糖尿病病程进展过程中，由于高血压等诸多因素，可通过细胞内因子、活性氧基团及改变血流动力学等导致足突细胞的坏死及凋亡，足突细胞数目减少及功能减弱以及GBM的裸露等原因最终导致患者出现蛋白尿。近期研究发现，足突细胞的裂空隔膜上的蛋白分子的表达与nephrin基因密切相关，而该基因与肾小球滤过屏障选择功能密切相关［13－14］，并且nephrin下调及重新分布先于肾小球组织损害，是DN病程中的早期改变，且nephrin表达与蛋白尿的程度呈负相关，而已经有研究发现缬沙坦在阻止了nephrin下调后，小鼠蛋白尿有明显下降［15］，然而针对DM引起足突细胞的损伤，除了严格控制血糖、抑制肾素－血管紧张素－醛固酮系统（renin－angiotensin－aldosterone system，RAAS）外，并无其他治疗方法，因此积极寻找抑制足突细胞损伤，控制DN病情进展的药物迫在眉睫。

近年来研究发现，大黄酸具有改善糖代谢，逆转胰岛素抵抗作用，对治疗DN有一定效果，但是大黄酸除了抑制内皮细胞PAI－1的表达，保护内皮功能逆转胰岛素抵抗预防糖尿病高血糖对肾脏的影响外，是不是还对肾脏足突细胞本身有一定作用，目前尚无研究。本实验采用STZ 60mg／kg一次性腹腔注射方式制作大鼠DN模型，并给予大黄酸灌胃给药8周，后取肾脏行病理活检及免疫组化发现模型组与大黄酸治疗组比较，nephrin表达下调受到抑制，与对照组比较差异有统计学意义，本实验研究发现大黄酸对DN不止与改善糖代谢、逆转胰岛素抵抗、抗炎等功能有关，而且与nephrin基因的表达有一定关系，可能是通过nephrin蛋白的损伤，维持足突细胞完整性有一定作用，但是最佳剂量及不良反应等尚需进一步实验来证实。

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