糖尿病对大鼠肝纤维化组织TIMP－1／MMP－1表达的影响＊

陈 枫，杨爱萍，李 燕，史小玲，唐小平，唐 莉，王晓燕，陈 庄△

（1.泸州医学院附属医院，四川 泸州 646000；2.兰州大学第二医院，兰州 730030）

糖尿病是以慢性血糖水平增高为特征的代谢疾病群。中国糖尿病和糖尿病前期患病率分别高达9.7%和15.5%［1］。持续性高血糖对许多脏器如肾脏、心脑血管纤维化具有明显促进作用，与肝脏纤维化的关系也在研究之中［2－3］。但其机制未能完全阐明。肝细胞外基质（extracellular matrix，ECM）分解代谢平衡主要是由TIMPs／MMPs系统调控，其中金属蛋白酶组 织 抑 制 剂－1 （tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1）／金 属 基 质 蛋 白 酶－1 （matrix metalloproteinase－1，MMP－1）的变化更能准确反映肝脏中ECM的合成和降解情况［4］。为了更好地分析高血糖对肝纤维化的影响，TIMP－1／MMP－1系统在糖尿病相关性肝纤维化中的作用，现将糖尿病对大鼠肝纤维化组织TIMP－1／MMP－1表达的影响报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 链尿佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司）；柠檬酸、柠檬酸三钠（上海前尘生物公司）；四氯化碳（国药集团化学试剂公司）；透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型胶原蛋白（collagen typeⅣ，C－Ⅳ）和Ⅲ型前胶原（procollagen typeⅢ，PⅢNP）试剂（郑州安图生物公司）；总RNA试剂盒（北京天根生化公司）；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0，SYBR Premix Ex TaqⅡ（大连宝生物公司）；MMP－1、TIMP－1、β－actin RT－PCR扩增引物（上海生工合成，引物序列见表1）；微量血糖测定仪，血糖试纸（美国强生公司）。pH4.5的柠檬酸缓冲液配制：A液0.1mol／L的柠檬酸；B液0.1mol／L的柠檬酸三钠，A∶B＝1∶1.32（用前配制）；1%STZ溶液配制：称所需质量的STZ，溶于其相应体积的pH4.5的柠檬酸缓冲液中（腹腔注射前溶解）。

表1 RT－PCR基因及引物序列

1.2 动物模型 清洁级健康雄性SD大鼠，体质量300～350 g，共40只，购于重庆第三军医大学动物实验中心。大鼠适应性饲养1周，随机分为正常对照组、糖尿病组、肝纤维化组、糖尿病肝纤维化组（双模型组），各10只。实验前大鼠尾尖采血，测定血糖值，正常大鼠方可用于试验。正常对照组：腹腔注射同体积的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液和花生油溶液。糖尿病组：一次性腹腔注射STZ 35mg／kg，48h尾尖采血，测定血糖大于16.7mmol／L为糖尿病模型大鼠［5］。肝纤维化组：皮下注射40%的四氯化碳花生油溶液，首次剂量0.4mL／kg，以后每隔3天注射0.2mL／kg。双模型组：一次性腹腔注射STZ 35mg／kg，48h尾静脉采血，测定血糖，7d后重复测定血糖，血糖大于16.7mmol／L的大鼠皮下注射40%的四氯化碳花生油溶液，首次剂量0.4mL／kg，以后每隔3天皮下注射0.2mL／kg，8周末腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，处死各组大鼠。心脏取血、剖腹取肝组织。

1.3 指标检测 全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶（alaniine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotran－sferase，AST）、血浆清蛋白（albumin，ALB）和清蛋白／球蛋白（A／G）。化学发光法测定 HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ。RT－PCR（SYBR Green相对定量法）检测肝脏组织α－平滑肌肌动蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）、MMP－1和TIMP－1表达。取肝脏组织50mg磨碎，提取总RNA，制备cDNA模板，反转录反应体系：MgCl22μL、10RT Buffer 1μL、dNTP Mixture 1μL、RNase Inhibittor 0.25μL、AMV Reverse Transriptase 0.5μL、Oligo dT－Adaptor Primer 0.5μL、RNase Free d H2O 3.75μL、样品RNA 1μL、Total volume 5μL。30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。

RT－PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dH2O 8.5μL、样品RNA 2μL、Total volume 25μL。95℃30s，95℃5s，59.5℃10s，检测实时荧光，共40个循环；65～95℃生成融解曲线，每个步骤10s，＋0.5℃／循环并行实时荧光检测，共60个循环。

病理检测：实验结束以后，将大鼠处死，剖腹取肝脏，固定，脱水，石蜡包埋，VG染色。

1.4 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行数据处理，计量资料以表示。对样本数先行方差齐性检验，方差齐时用One－Way ANOVA检验。方差不齐时用Kruskal－Wallis H检验比较总的差异，再用Mann－Whitney U检验进行两组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠肝功能指标 与正常对照组比较，肝纤维化组和双模型组ALT、AST浓度明显升高，ALB、A／G明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与糖尿病组比较，肝纤维化组、双模型组ALT、AST浓度明显升高和ALB、A／G明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与肝纤维化组比较，双模型组ALT、AST升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2 大鼠血清肝纤维化指标 与正常对照组比较，肝纤维化组、双模型组HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ 明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与糖尿病组比较，肝纤维化组、双模型组HA、LN、PⅢNP、C－Ⅳ 明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与肝纤维化组比较，双模型组HA、C－Ⅳ升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.3 肝组织VG染色变化 正常对照组肝脏肝小叶结构正常，肝细胞索排列规则有序，未见脂肪变性、坏死，无胶原纤维增生；糖尿病组肝脏结构基本正常，少量出现炎性坏死、脂肪变性；肝纤维化组肝细胞广泛脂肪变性、坏死，炎性细胞浸润，以汇管区及中央静脉周围较重。有纤维组织增生的情况，但未形成假小叶；双模型组中大部分肝小叶结构破坏，肝细胞索排列失去放射状结构，纤维结缔组织增生形成宽窄不一的纤维条索，伸入肝实质中，形成纤维间隔，包绕、分割正常肝组织，形成假小叶。见图1和表4。

表2 4组大鼠肝功能指标比较

表2 4组大鼠肝功能指标比较

a：P＜0.05，与正常对照组比较；b：P＜0.05，与糖尿病组比较；c：P＜0.05，与肝纤维化组比较。

组别 n ALT（U／L） AST（U／L） ALB（g／L） A／G正常对照组 10 68.460±17.534 106.928±19.659 42.582±7.667 1.235±0.420糖尿病组 10 85.723±18.998 112.615±20.178 42.446±7.915 1.228±0.143肝纤维化组 10 171.532±17.415ab 175.518±23.711ab 32.046±9.982ab 0.711±0.312ab双模型组 10 224.914±23.321abc 234.058±18.001abc 31.762±7.768ab 0.703±0.408ab

表3 4组大鼠肝纤维化指标浓度的比较（ng／mL

表3 4组大鼠肝纤维化指标浓度的比较（ng／mL

a：P＜0.05，与正常对照组比较；b：P＜0.05，与糖尿病组比较；c：P＜0.05，与肝纤维化组比较。

组别 n HA C－Ⅳ PⅢNP LN正常对照组 10 88.856±11.848 8.206±0.953 8.717±4.546 6.026±2.331糖尿病组 10 97.808±19.123 10.991±3.315 8.720±2.582 7.085±2.404肝纤维化组 10 194.892±14.594ab 16.223±3.217ab 15.122±5.335ab 10.561±1.319ab双模型组 10 251.484±63.466abc 20.184±5.032abc 15.646±2.992ab 10.811±4.026ab

图1 4组大鼠肝组织胶原纤维影像表现（VG染色，×100）

表4 4组大鼠纤维化分期和计分的比较）

表4 4组大鼠纤维化分期和计分的比较）

a：P＜0.05，与肝纤维化组比较。

组别 n 分期（n）0 1 2 3 4 计分（分）正常对照组 10 10 0 0 0 0 0糖尿病组 10 10 0 0 0 0 0肝纤维化组 10 0 0 4 4 2 8.7±5.420双模型组 10 0 0 2 4 4 13.6±6.813a

2.4 肝脏组织α－SMA、MMP－1和TIMP－1基因表达 与正常对照组比较，肝纤维化组和双模型组α－SMA、TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表 达 升 高，差 异有 统 计 学 意 义 （P＜0.05）；与糖尿病组比较，肝纤维化组和双模型组α－SMA、TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与肝纤维化组比较，双模型组α－SMA和TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。正 常 对 照 组 和 糖 尿 病 组 中 α－SMA、TIMP－1 及TIMP－1／MMP－1基因表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），各组间MMP－1基因表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 4组大鼠肝脏组织中的α－SMA、TIMP－1和MMP－1基因表达水平的比较

表5 4组大鼠肝脏组织中的α－SMA、TIMP－1和MMP－1基因表达水平的比较

a：P＜0.05，与正常对照组比较；b：P＜0.05，与糖尿病组比较；c：P＜0.05，与肝纤维化组比较。

组别 n α－SMA TIMP－1 MMP－1 TIMP－1／MMP－1正常对照组 10 1.412±0.237 1.103±0.777 1.064±0.681 0.973±0.772糖尿病组 10 1.992±0.166 1.134±0.306 1.134±0.122 1.000±0.091肝纤维化组 10 3.285±0.054ab 3.816±0.887ab 1.488±0.421 2.561±0.307ab双模型组 10 17.927±0.672abc 6.920±0.588abc 1.619±0.524 4.279±1.414abc

3 讨 论

糖尿病与肝纤维化有密切关系，可促进肝纤维化的进展，增加肝硬化和肝癌的发生［6－8］。同时，慢性肝损伤也可以影响糖代谢，形成恶性循环，但其机制未能阐明。高血糖作为糖尿病的重要表现，是各型糖尿病的共同特征。本研究采用链尿佐菌素诱导建立糖尿病模型，通过破坏胰岛β细胞，诱发大鼠形成糖尿病。四氯化碳是常用的中毒性肝纤维化诱导物，通过细胞色素氧化酶代谢为三氯甲基自由基从而导致肝细胞损伤，肝细胞出现坏死、凋亡［9］，反复刺激形成了炎症细胞集聚、释放细胞因子触发间质组织的过量胶原纤维产生肝纤维化。当肝纤维发生时，细胞中ALT、AST释放于血清是肝细胞炎症和坏死的血清学指标；ALB、A／G是肝细胞合成代谢功能的指标，其降低程度与肝脏合成功能损害程度呈正比。ECM主要由胶原蛋白、LN、HA等成分组成，所以，ECM及其代谢产物是研究血清标志物的首选。目前，HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ为常见的临床检测肝纤维化血清学指标，同时酶促化学发光法检测具有密度好、准确性高、溶血对检测干扰少等优点［10－11］。本研究结果显示，糖尿病组与正常对照组比较，各项指标没有显著区别，表明早期糖尿病对肝脏功能影响较小。肝纤维化组中，ALT、AST、HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ浓度高于正常对照组和糖尿病组，ALB、A／G明显降低（P＜0.05），加之病理改变，证实造模成功。双模型组与肝纤维化组比较，ALT、AST、HA和C－Ⅳ差异有统计学意义（P＜0.05），双模型组是肝纤维化模型加糖尿病模型，说明糖尿病加重了肝脏纤维化程度，促进了肝纤维化的发展。其结果也与组织切片VG染色结果相符合，在大鼠纤维化分期和计分的比较中，双模型组与肝纤维化组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

肝纤维化是各种慢性肝病的病理特征，其发生机制是ECM过度增生和异常沉积。研究表明，肝纤维化发生中心环节是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活和增殖。当各种因素引起HSC激活后，HSC转变为肌成纤维细胞并特异性表达α－SMA，主要表达于HSC胞核，说明α－SMA是HSC激活标志，进而成为提示肝纤维化病情严重程度的重要指标［12］。通过RT－PCR结果观察到，与正常对照组和糖尿病组比较，肝纤维化组、双模型组α－SMA的表达明显升高（P＜0.05）；与肝纤维化组比较，双模型组α－SMA的表达升高（P＜0.05）。这与方瑜洁等［13］的研究结果一致，提示高血糖可以促进肝脏HSC活化、增殖，从而加重大鼠肝纤维化的程度。因此，HSC激活在糖尿病相关性肝纤维化的形成过程中可能起着重要的促进作用。Sugimoto等［14］通过体外实验发现，高血糖可以引起HSC增生和Ⅰ型胶原的产生，提示高血糖是促进肝纤维化发展的重要因素。其他体外实验也观察到，不同高浓度的葡萄糖均能刺激HSC并导致HSC增殖，且DNA合成呈剂量依赖性［15］。所以，糖尿病持续性高血糖对肝纤维化的影响可能是通过激活HSC和增加胶原ECM的产生，进而加重肝纤维化。

肝纤维化的产生是由于MMPs活性下降和（或）TIMPs活性升高导致ECM的合成和降解的失衡，从而出现ECM在肝内过度沉积。MMPs是一组锌离子依赖酶，它对于ECM中细胞外大分子如胶原具有降解作用，因此，是调节ECM动态平衡最重要的一大酶系［16］；TIMPs是一组有抑制MMPs功能的活性多肽，与等比例的MMPs以共价键可逆结和形成复合体，从而抑制MMPs的活性。所以，TIMPs／MMPs系统在维持肝脏中ECM平衡起着重要作用。MMP－1是MMPs家族的一员，主要降解ECM中的Ⅰ、Ⅲ型胶原［17］，MMP－1的活性主要受特异性抑制物TIMP－1的调节。有研究表明，在肝纤维化发展过程中，TIMP－1的表达增强，TIMP－1／MMP－1的比值升高，使ECM降解减少，增加了胶原纤维的积累并促进肝纤维化的发展，是肝纤维化形成的重要因素［18］。因此，TIMP－1／MMP－1比值的改变更能准确地反映肝脏中ECM合成和降解的情况［4］。本研究结果表明，与正常对照组和糖尿病组相比，肝纤维化组中TIMP－1表达增加、MMP－1变化不明显，从而引起的TIMP－1／MMP－1改变导致肝纤维化的发生，与文献［19］一致。与肝纤维化组比较，双模型组 TIMP－1、TIMP－1／MMP－1表达升高（P＜0.05），由此说明高血糖状态下大鼠肝纤维化程度加重与TIMP－1表达增加相关，而不是 MMP－1表达减少，所以，TIMP－1／MMP－1失衡加剧了ECM的形成。糖尿病持续性高血糖影响TIMP－1／MMP－1系统的平衡，其可能的机制：高血糖激活了HSC的表达，激活的HSC释放大量的TIMP－1，从而导致了TIMP－1／MMP－1失衡。其可能的机制还有高血糖状态可能分泌大量 TNF－α、IL－1等炎症介质［20］，它们可以进一步刺激 HSC 增 殖，影 响 TIMP－1／MMP－1的 平 衡。Wakisaka等［21］研究认为，在高血糖情况下，ECM成分的改变会影响MMPs的表达。正常情况下，ECM中的正常成分通常作为ECM分泌的负反馈调节信号。在血糖高的情况下，这种负反馈调节机制被破坏，影响了TIMP－1／MMP－1正常表达和形成ECM的沉积。

因此，糖尿病加重肝纤维化发生的机制与TIMP－1／MMP－1的失衡有密切关系。深入研究糖尿病肝纤维化过程中HSC激活和TIMP－1／MMP－1调节性失衡异常的机制，可以更好地阐明糖尿病相关性肝纤维化的发病机制，为临床上防治糖尿病相关性肝纤维提供新的思路和治疗方法。

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