间隙连接基因Cx32在肝细胞癌与肝炎中的表达意义分析

周 任

（广西壮族自治区玉林市第一人民医院肝胆外科 537000）

肝癌是一种临床常见的恶性肿瘤，其死亡率在消化系统肿瘤中仅次于胃癌和食管癌，位居第3，并且发病率在中国逐渐升高，严重影响了人民群众的身体健康［1］。连接蛋白（Cx）是由连接基因家族编码的一组蛋白质，其作为细胞间隙连接通讯的结构基础，参与细胞生长到死亡的全部生命过程，具有重要的调控作用［2］。研究表明肝癌与Cx表达异常有关，但是具体的机制还不太清楚［3］。因此，了解间隙连接基因Cx32的调节机制，恢复正常表达是目前抗肿瘤研究的热点之一［4］。本文为此应用蛋白杂交，RT－PCR分别检肝细胞癌、肝炎组织和正常肝组织中Cx32蛋白及Cx32mRNA水平，以探讨间隙连接基因Cx32在肝细胞癌与肝炎中的表达意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本和试剂 收集本院2008年2月至2011年3月30例肝细胞癌及30例肝炎标本，都为外科手术切除标本，所有标本均经病理学检查证实。所有病例术前均未经过放疗和化疗。其中，男40例，女20例，年龄28～62岁，平均（45.25±8.24）岁。30例正常肝组织标本为同期医院收治的外科外伤性肝破裂患者的手术切除标本，并除外其他肝脏疾病，其中，男20例，女10例，年龄25～60岁，平均（45.85±6.82）岁。所有标本取下后用预冷的生理盐水冲洗，均在离体后0.5h内置入－196℃的液氮中保存。试剂：Cx32鼠抗人单克隆抗体（美国zymed公司），β－actin鼠抗人单克隆抗体（美国Sigma公司），ECL试剂盒（Pharmacia公司），Trizol（美国 MRC公司），AMV逆转录试剂盒（美国Promega公司），PCR引物（大连宝生物工程公司），Taq酶（大连宝生物工程公司）。

1.2 引 物 设 计 Cx32上 游 引 物：5′－CAG CTT GTT GAT CTC ATT CTG C－3′，下游引物：5′－GCA TCA TCC TCA ATG TGG C－3′，目的片段长度 150bp；β－actin上游引物：5′－ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A－3′，下 游 引 物：5′－CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA－3′，目的片段长度318bp。

1.3 蛋白杂交分析 用RIPA buffer提取蛋白质，DC protein assay法测定总蛋白含量，取等量蛋白质行SDS－PAGE凝胶电泳。转膜、封闭后，加鼠抗人Cx32单克隆抗体（1∶500），HRP标记的兔抗鼠二抗（1∶10 000），ECL试剂盒检测Cx32蛋白信号。Bandscan9.0软件进行灰度值扫描分析。

1.4 RT－PCR分析 分别取上述3种组织50～100mg于匀浆器内，加1mL Trizol反复抽吸匀浆，裂解后倒入1.5mL EP管内；加入氯仿0.2mL，剧烈摇摆15s后置于室温下10min；4℃离心，12 000r／min离心15min；取上层液相置于另一1.5 mL EP管内；加入0.5mL异丙醇混匀，室温下放105min；4℃离心，12 000r／min离心10min，弃去上清液；加入75%乙醇1mL，混匀后4℃离心，12 000r／min离心5min；弃去上清，将EP管倒置，干燥10min左右；加入20μL DEPC水溶解；按照常规方法进行反转录。按以下配制PCR反应液（总反应体系50μL）：5×PCR Buffer 10μL，灭菌蒸馏水28.75μL，TaKa－Ra ExTap 0.25μL，上、下游特异性引物各0.5μL和cDNA 10 μL。放入PCR仪内，按以下条件进行PCR扩增，退火温度为58℃，延伸时间1min。同时扩增内标物：GAPDH。PCR反应结束后取5～10μL反应产物行0.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线下成像。用Bandscan5.0软件进行灰度扫描分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计学分析处理，所有结果以表示，计量均数资料比较用方差分析，有显著差异者再进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 蛋白杂交结果 灰度扫描与灰度值结算结果分析显示肝癌组织Cx32蛋白杂交产物灰度值显著低于正常肝组织（P＜0.01），并显著低于肝炎组织（P＜0.05）。具体情况见表1。

表1 3组间Cx32蛋白杂交检测产物灰度值比较

表1 3组间Cx32蛋白杂交检测产物灰度值比较

组别 n Cx32正常肝组织30 0.951±0.06肝炎组织 30 0.750±0.05肝细胞癌组织 30 0.530±0.10 F 12.362 P 0.000

2.2 RT－PCR结果 灰度扫描与灰度值结算结果分析显示Cx32mRNA肝细胞癌组织、肝炎组织及正常肝脏中的表达含量类似，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。具体情况见图1与表2。

表2 3组间Cx32蛋白RT－PCR检测产物灰度值比较

表2 3组间Cx32蛋白RT－PCR检测产物灰度值比较

组别 n Cx32／β－actin正常肝组织30 1.15±0.15肝炎组织 30 1.36±0.14肝细胞癌组织 30 1.24±0.08 F 0.625 P 0.963

图1 Cx32蛋白RT－PCR检测产物图

3 讨 论

连接蛋白是由连接蛋白基因家族编码的一组蛋白质，它们在不同的细胞、组织、器官以及其不同发育时期的表达都有所不同［5］。同一种细胞也可有表达几种不同的连接蛋白，同一组织与器官也可以包含多种连接蛋白，它们是构成细胞间隙连接主要组成成分，广泛存在于多细胞动物间，是细胞间隙连接通讯的结构基础［6］。

近年的研究显示，肿瘤组织中常伴有细胞间隙连接通讯的异常，主要表现为肿瘤细胞的同型细胞间隙连接通讯减少，从而使肿瘤细胞脱离机体的调控，导致肿瘤无限增殖［7－8］；另一方面，通过共同培养、药物干预可使连接蛋白表达得到恢复，从而可抑制肿瘤生长［9］。有研究表明Cx基因表达不仅受到甲基化调节，其调节作用还受到糖皮质激素、转录因子等的影响［10］。而基因异常甲基化是癌变的早期事件，可望通过药物干预恢复正常甲基化模式，从而达到防治肿瘤的目的。最新研究显示胞间隙连接蛋白Cx32、Cx43蛋白表达明显受抑，且随肝细胞肝癌恶性程度的升高而表达逐级递减，与肝细胞肝癌的发生密切相关。同时发现，Cx32mRNA、Cx43mRNA在肝细胞肝癌组织和正常肝组织中均无明显的变化，提示肝癌细胞Cx32、Cx43基因表达过程中转录正常，而在翻译或翻译后蛋白质加工、修饰过程存在异常。Cx43蛋白酪氨酸磷酸化作用，使细胞间间隙连接通讯功能受到抑制，胞内第二信使游离钙浓度（［Ca2＋］i）的改变是该信使系统反应的关键。系统、全面地揭示肝细胞肝癌发生、发展的重要分子机制，探讨肝细胞癌早期诊断和判断预后的有效指标，并开辟肝细胞癌基因治疗的新途径［11］。在前人的Cx32免疫组织化学实验中，也发现Cx32蛋白在肝细胞癌组织的表达低于肝炎组织及正常肝脏中［12］。

本实验结果显示，肝癌组织Cx32蛋白杂交产物灰度值显著低于正常肝组织（P＜0.01），并显著低于肝炎组织（P＜0.05）。而肝炎组织和正常肝组织中该蛋白无明显差异，提示肝细胞癌中Cx32蛋白表达的减少可能是肝细胞癌发生的重要机制之一。同时结果也发现，Cx32mRNA在肝细胞癌组织、肝炎组织及正常肝脏中的表达含量类似，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。提示肝细胞癌中Cx32蛋白缺失可能是Cx32基因在翻译或蛋白质的加工修饰过程中异常所致。

总之，Cx32基因作为抑癌基因，在肝癌组织中Cx32蛋白表达下调，可能是肝癌组织的重要机制之一，而Cx32蛋白缺失可能与Cx32基因在转录后的翻译或翻译后蛋白质的加工修饰过程异常相关。

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