马病毒性动脉炎病毒中和试验的建立以及与ELISA方法的比较研究

张海明，郑丽兰，段晓冬，相文华，沈 丹，薛 红，梁卓粤，彭南秀，程 忠，彭 聪

（1.广州市动物卫生监督所 广州市动物疫病预防控制中心，广东广州 510440；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150001）

马病毒性动脉炎（equine viral arteritis，EVA）是由马动脉炎病毒（equine arteritis virus，EAV）所引起的马属动物的一种接触性传染性病毒病[1]。该病早先发现于美国俄亥俄州，并由Doll等人从马流产胎儿中首次分离出马动脉炎病毒[2]。目前，马病毒性动脉炎存在于世界各地的马群中[3]。该病多呈亚临床感染，也可引发不同程度的症状，比如发烧、精神沉郁、食欲减退、四肢以及阴囊和包皮坠性水肿、结膜炎、皮肤麻疹块和流产等。在幼驹，虽然不多见，但可暴发肺炎或肺肠炎。除了马驹之外，其他日龄马感染后病死率通常都很低，感染马几乎毫无例外都能完全临床康复，但很大一部分种公马会长期带毒，而母马、去势马和性未成熟的小马尚未发现有带毒现象。

马病毒性动脉炎是我国的二类动物疫病，也是全世界各国进出口检疫非常重视的马属动物疫病之一。该病的诊断方法主要有补体结合试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验、琼扩试验、病毒中和试验、聚合酶链氏反应技术和病毒分离等。其中，病毒中和试验由于其敏感性高、特异性强等特点，被公认是马病毒性动脉炎抗体检测的“金标准”[4]，同时也是世界动物卫生组织（OIE）推荐的马病毒性动脉炎诊断方法。但是由于ELISA方法具有操作简单、便于大规模筛查和灵敏度高等特点，目前已有较多ELISA方法成功建立和应用的报道[5-7]。为了解这两种方法检测结果的符合性，笔者建立了马病毒性动脉炎病毒中和试验，并与ELISA方法进行比较，以期为我国马病毒性动脉炎检测工作特别是广东从化无规定马属动物疫病区维护工作中马病毒性动脉炎检测方法的选择提供借鉴。

1 材料

1.1 RK-13细胞系

兔肾细胞（RK-13细胞）系由广东省出入境检验检疫局惠赠。

1.2 细胞培养用试剂

MEM培养液、胎牛血清、胰酶EDTA购自美国Invitrogen公司。

1.3 病毒和血清

马病毒性动脉炎病毒标准毒株（Bucyrus株）由广东省出入境检验检疫局惠赠；标准阳性血清购自美国NVSL；马病毒性动脉炎标准阴性血清批号为372EDV0201，中等抗体效价标准阳性血清批号为370EDV1101，高抗体效价标准阳性血清批号为999-EOS-EVA；马鼻肺炎阳性血清、马传染性贫血阳性血清和马流感阳性血清由中国农科院哈尔滨兽医研究所馈赠。

马血清来自广东省部分地区马场，由本实验室采集并保存。

1.4 豚鼠补体

豚鼠补体购自美国Rockland公司，批号为22049。

1.5 ELISA试剂盒

马病毒性动脉炎抗体ELISA商品化试剂盒为西班牙INGENASA公司产品，试剂盒批号为200612。

2 方法

2.1 病毒制备与病毒TCID50的测定

取马动脉炎病毒标准毒株1 mL接种于刚长满单层的RK-13细胞上，37 ℃感作1 h后倒去病毒液，再加入含2%胎牛血清的MEM维持液，37 ℃培养30～40 h，每天进行观察，待大部分细胞出现细胞病变（CPE）时，反复冻融3次后收集培养液，用Reed-Muench法进行病毒TCID50的测定。

2.2 病毒中和试验操作

将待检马血清和标准阴阳性血清于56℃水浴中灭活1 h待用。将待检马血清用2%MEM维持液进行1:2和1:4稀释后加入到灭菌V型96孔板中相应位置中，并设置好血清空白对照。于另一块灭菌V型96孔板中设标准阳性对照，用2%MEM对马病毒性动脉炎标准阳性血清从1:2开始进行倍比稀释。并设立病毒对照。

于所有除血清空白对照外的孔中加入含有10%补体的工作浓度的EAV，37 ℃细胞培养箱中作用1 h后，将所有液体转移到已准备好的含有RK-13细胞的细胞板的相应位置中，每天观察，48 h后读取结果。

2.3 EVA病毒中和试验特异性试验

将马病毒性动脉炎标准阴阳性血清、马鼻肺炎阳性血清、马传染性贫血阳性血清、马流感阳性血清用EVA微量血清中和试验方法进行检测，每个样品设3个重复，取平均值比较结果。

2.4 EVA病毒中和试验重复性试验

对马病毒性动脉炎标准阳性血清（高抗体效价和中抗体效价）进行三次EVA病毒中和试验，记录检测得到的抗体效价。

2.5 EVA ELISA操作

按照试剂盒说明书进行操作，血清样品OD值大于cut off值（阴性血清对照OD450+0.2）的判定为阳性，即样品中存在马病毒性动脉炎抗体；否则为阴性。

3 结果

3.1 EAV在接种RK-13细胞约30～40 h即出现50%～75%左右的细胞出现病变，病变以细胞大量呈团状、拉丝状聚集，严重的出现细胞破碎和脱落。

3.2 根据Reed-Muench法对制备的EAV进行TCID50的测定，该批病毒的TCID50为10-6.5/0.1 mL。

3.3 该中和试验用EAV标准阴阳性血清作为对照，1:2和1:4稀释的标准阳性血清能完全中和工作浓度的马病毒性动脉炎病毒，而1:2和1:4稀释的标准阴性血清不能中和该病毒。

3.4 用马传贫、马流感和马鼻肺炎阳性血清进行交叉中和试验，均不能中和EAV，说明本试验方法具有较好的特异性。

3.5 用马病毒性动脉炎标准阳性血清（高抗体效价和中抗体效价）进行三次EVA病毒中和试验，检测得到的抗体效价在±1个滴度以内，说明本试验方法具有较好的重复性。

4 EVA病毒中和试验的初步应用以及与ELISA方法的比较

4.1 两种方法的结果

本实验对189份马血清分别进行了EVA病毒中和试验和ELISA的检测，结果在VNT检测中，阳性数为7份，阴性数为182份；在ELISA检测中，阳性数为16份，阴性数为173份，具体见表1。

表 1 马病毒性动脉炎VNT和ELISA检测结果

4.2 两种方法的比较分析

在ELISA检测的16份阳性血清中，VNT检测有5份阳性，阳性符合数为5份，阳性符合率为43.48%（5+5/16+7）；阴性符合数为171份，阴性符合率为96.34%（171+171/173+182），总符合率为93.12%（5+171/189），具体见表2、3。

表 2 马病毒性动脉炎VNT和ELISA检测结果比较

表 3 马病毒性动脉炎VNT和ELISA检测结果符合率

4.3 ELISA的敏感性与特异性

如果将我们建立的马病毒性动脉炎VNT作为EVA抗体检测的“金标准”，试验中所用ELISA的敏感性和特异性分别为71.43%和93.96%。

5 讨论

目前，除了对马精子进行病毒分离外，马病毒性动脉炎的检测主要依靠血清学方法。虽然病毒中和试验是OIE推荐的马病毒性动脉炎的检测方法，但由于病毒中和试验需要较高的实验条件和操作能力，以及检测结果的出具需要较长的时间，各种马病毒性动脉炎抗体ELISA商品化试剂盒应运而生。但是在过去几年的广东从化无规定马属动物疫病区马病监测工作中[8]，我们发现马病毒性动脉炎ELISA的检测结果与VNT的检测结果存在较大的差异，因此，我们建立了适合本实验室的马病毒性动脉炎病毒中和试验，并与商品化的EVA ELISA试剂盒进行比较。

根据我们的比较结果，ELISA方法能检出更多的阳性结果，这可能与ELISA方法本身可能产生较多的假阳性有关[9]。另外，EVA VNT检测到的是中和抗体，而ELISA检测到的一般情况下是非中和抗体，这也可能是两者检测结果不同的原因之一。而对于ELISA无法检出部分VNT检测阳性的血清，另一个可能的原因是，对于那些包被GP5蛋白的ELISA方法，目前已发现有部分EVA毒株编码GP5的基因发生一定的改变而导致ELISA无法检出这些毒株所诱发的抗体[1]。

我们通过两种检测方法的比较和分析发现，马病毒性动脉炎VNT和ELISA检测马血清的阴性符合率较高，而阳性符合率较低，因此，如果用ELISA作为EVA检测的筛查甚至替代VNT进行检测，可能会导致部分阳性血清的漏检。另外，以我们建立的VNT作为马病毒性动脉炎抗体检测的“金标准”，试验中所用的ELISA方法的敏感性和特异性分别为71.43%和93.96%，与Duthie等[5]的试验结果一致，说明ELISA方法在检测马病毒性动脉炎抗体时，特异性较高，但也存在敏感性不够的问题。

综上所述，我们认为在马病毒性动脉炎抗体检测中，不能以ELISA替代病毒中和试验，也不能采用以抗体ELISA进行筛检然后对阳性样品用病毒中和试验进行确诊的方法。

致谢：在本实验完成过程中得到了爱尔兰马病中心、广东省出入境检验检疫中心、山东出入境检验检疫中心等单位的大力支持和帮助，在此表示真诚的感谢。

[1]OIE. Manual of Diagnosis Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [M]. Paris：OIE，2008：904-918.

[2]Jones T C，Doll E R，Bryans J T. The lesions of equine viral arteritis [J]. Cornell Vet，1956，47（1）：52-68.

[3]黄从平，梁成珠，朱来华. 马病毒性动脉炎的研究进展[J].河南畜牧兽医，1999，20（5）：25-27.

[4]Cho H J，Entz S C，Deregt D，et al. Detection of antibodies to equine arteritis virus by a monoclonal antibody-based blocking ELISA [J]. Can J Vet Res，2000，64（l）：38-43.

[5]Duthie S，Mills H，Burr P.The efficacy of a commercial ELISA as an alternative to virus neutralisation test for the detection of antibodies to EAV [J]. Equine Vet J，2008，40（2）：182-183.

[6]梁成珠，曹瑞兵，魏建超，等. 马动脉炎病毒GL 蛋白主要抗原域的表达及间接ELISA 的初步建立[J]. 微生物学报，2006，46（3）：436-440.

[7]彭聪，王奕青，周彩信，等. 广州亚运无规定马属动物疫病区建设与探讨[J]. 中国动物检疫，2011，28（8）：9-18.

[8]彭聪，沈丹，彭南秀，等. 广州亚运无疫区动物疫病监测与净化[J]. 中国动物检疫，2012，29（7）：47-52.

[9]Cook R F，Gann S J，Mumford J A. The effects of vaccination with tissue culture-derived viral vaccines on detection of antibodies to equine arteritis virus by enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）[J]. Vet Microbiol，1989，20（2），181-189.