肉牛支原体肺炎的诊断

周秀玲，李知新，李 忠，赵 燕，田进梅

（宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750002）

2012年9月11日，宁夏中卫市移民新村养殖户从外省某县调入4～6月龄肉牛86头，在调出地进行了口蹄疫O型-Asia-I型双价疫苗免疫，调入后7头牛出现咳嗽、鼻孔流淡红色黏液，经当地兽医用青霉素、安痛定等药物治疗，效果不佳。至2012年9月25日，死亡9头，其余均出现相似的临床症状。剖解发现气管和喉头黏膜充血、出血，喉头外膜和肌肉有米粒大小的出血点，肺脏出血、呈酱紫色、质地松脆，胸腔有大量暗红色积液。综合临床症状，病原分离鉴定及RT-PCR检测，确诊为牛支原体肺炎。

1 材料与方法

1.1 样品的采集 采集疫点疑似发病牛肺组织病变区3份，同群发病牛鼻腔棉拭子77份。采集非疫区健康牛鼻拭子5份。

1.2 材料与试剂 PCR扩增仪为Biometra公司生产；紫外凝胶成像系统、核酸蛋白检测仪、电泳仪均为Bio-Rad公司生产；PPLO肉粉为美国BD公司产品；琼脂粉、酵母粉、马血清、精氨酸、10×MEM为Gibco公司产品；葡萄糖为西安化学试剂厂产品；青霉素为宁夏启元药业有限公司产品；High pure Viral RNA Kit为Roche公司产品；PrimeScript One-Step RT-PCR kit Ver.2购自大连宝生物工程有限公司；Marker DL2000购自北京博迈德科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPLO固体培养基的制备 按300 mL配制。取葡萄糖1.5 g、PPLO肉粉6.3 g、琼脂粉4.5 g、酵母粉1.5 g，加三蒸水260 mL，121 MPa高压20～25 min，待冷却到40 ℃，加入马血清30 mL、10%精氨酸6 mL、10×MEM 3 mL、8万单位过滤青霉素3mL，混匀。25 mL倒一个培养基，置4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 牛支原体肺炎的培养 将无菌采集的肺脏组织，用pH7.2的PBS液按1:5比例匀浆，取200 uL上清液体涂板。5% CO2培养箱24～72 h。观察并记录结果。

1.3.3 引物 本实验室保存。按照文献[1，3]合成：P1：5'-TATTATTTTTGCATGAAAGTAATAT-3'，P2：5'-CGTCAAGGTAGCATCATTTC-3'。 预 计 产物大小为310 bp。

1.3.4 RNA提取

病毒总RNA按Roche公司High pure Viral RNA Kit试剂盒说明书提取。

1.3.5 目的基因的扩增

一步法RT-PCR扩增反应组分为：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 mL，2×1 Step Buffer 12.5 mL，上游引物P1（10 pmol/mL）1 mL、下游引 物 P2（10pmol/mL）1 mL、模板 RNA 3 mL、Rnase-free Water 6.5 mL。总体系25 mL；反应条件为：42 ℃ 40 min，95 ℃ 3 min，反应参数：94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 病原分离鉴定结果

对疑似牛肺脏组织接种支原体固体培养基，5%CO2培养箱24～72 h，可发现有典型“煎鸡蛋”样菌落。

2.2 RT-PCR检测结果

对疑似患病牛肺脏组织和同群牛鼻拭子进行牛支原体RT-PCR检测，得到目的条带，经2.0%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出了大约310 bp的条带（图1），与预期结果一致。

3 讨论与分析

据报道，牛呼吸系统病原混合感染中，牛支原体肺炎居首位[1]，可引起牛的肺炎、关节炎、中耳炎、脑膜炎等多种疾病[2]。1961年美国学者首次从患有乳房炎的病牛中分离到该病原[2]，该病在北美和亚欧等国引起广泛传播和蔓延，造成严重的经济损失[1-5]。中国2008年分离到该病原，随后在我国16个省传播和蔓延[6]。宁夏2009年由外调引进该病，牛引进本地后可迅速发病，并能引起同群本地牛发病，发病率可达100%，死亡率较高[3-4]。这表明隐性带菌牛经调运后进入非疫区，不但能在短时间内发病，而且能够引起与其有接触史的牛发病，如若不加控制，死亡数和感染数会急剧增加。

牛支原体肺炎检测的常用方法有病原分离鉴定、ELISA和分子生物学检测等。病原培养需要特殊条件，培养时间相对较长；目前在比利时、加拿大、瑞士等国家已有商品化的抗体ELISA试剂盒，检测时间短，适合临床大批量检测。由于中国没有相关牛支原体肺炎疫苗进行防治，因此在调运牛之前，建议采用上述ELISA试剂盒头头检测调运牛。对有疑似症状的牛建议采集牛鼻腔拭子或肺脏病变区，进行分子生物学方法进行检测。发现阳性畜，应及时隔离扑杀，严格对场地消毒，同时还应对其他易感牛及时检测，从而达到有效的预防和控制作用。

[1]张永强，张 维，王清华，等.牛支原体肺炎流行RT-PCR方法的初步诊断[J].中国动物检疫，2011，28（6）：48-49.

[2]Nicholas R A，Ayling R D. Mycoplasma bovis：diagnosis and control[J]. Res Vet Sci，2003，74（2）：105-112.

[3]李知新，王进香，闫小芹，等.宁夏牛支原体肺炎RT-PCR方法的诊断[J].中国动物检疫，2012，29（1）：44-45.

[4]王晓亮，李知新，王进香，等.宁夏牛传染性牛支原体肺炎的血清学调查[J].中国动物检疫，2011，28（6）：56-57.

[5]石 磊，龚 瑞，尹争艳，等.肉牛传染性支原体肺炎流行的诊断[J].华中农业大学学报，2008，27（5）：629-633.

[6]李 媛，董 慧，张美晶，等.牛霉形体PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2009，39（5）：416-420.