布鲁菌在Bact／Alert血培养仪上生长曲线特点

郭素芳，魏瑞霞，张 勇，福 泉，张军力

2.内蒙古鄂尔多斯市准格尔旗人民医院。

布鲁菌是一种动物源性人畜共患病病原菌，可引起布鲁菌病。临床表现为多汗、反复发热、关节痛、肝脾肿大。人类对布鲁菌普遍易感。布鲁菌病以皮肤接触感染为主［1］，是牧业人员和某些职业人群感染布鲁菌的主要途径；其次，饮用生乳和食入污染布鲁菌的食物而发生消化道传染。临床布鲁菌主要分离自血液，由于此菌临床分离较少，关于该菌在Bact／Alert血培养仪上生长曲线特点的研究极少见。本院于2011年4月—2013年1月从15例患者血液中分离出15株布鲁菌，通过观察布鲁菌在Bact／Alert血培养仪上生长曲线特点，可帮助我们预测该菌株生长，协助临床快速诊断布鲁菌病。实验室对布鲁菌病的诊断有重要作用，从发热布鲁菌病患者的血液中或慢性感染患者的组织（如骨髓）中分离布鲁菌是诊断该病的金标准［2］。

材料与方法

一、材料

（一）病例（菌株）来源 2011年4月—2013年1月从15例患者血液中分离出15株布鲁菌，血清布鲁菌凝集试验均为阳性，诊断为布鲁菌病，临床上均表现有不规则发热和动物接触史。

（一）仪器与试剂 Bact／Alert 3D全自动培养仪及厂家配套血培养瓶购自法国生物梅里埃公司。

二、方法

（一）标本采集 无菌采集血液10 mL，注入中和抗生素的需氧瓶和厌氧瓶，经仪器扫描识别后，直接放进培养仪，培养仪自动进行检测。

（二）实验室鉴定 血培养仪需氧瓶阳性报警，观察细菌生长曲线。注射器抽取血培养瓶中的样本转种到血平皿、巧克力平皿、麦康凯平皿35℃、5%CO2培养，并且进行尿素水解试验及涂片。4 h内尿素水解试验阳性，有布鲁菌生长的可能性极大。涂片可见革兰染色阴性球杆菌、染色很弱。柯氏染色法是鉴别布鲁菌很好的方法［3］，布鲁菌染成淡红色，为球杆菌，其他细菌或细胞为绿色（或蓝色），对比明显。72 h血平皿及巧克力平皿上生长出较小、灰色、圆形、突起、边缘整齐且不溶血的大小相同的小菌落，麦康凯平皿上无菌落生长。革兰染色为阴性球杆菌、染色弱、细沙样。15 min内尿素水解试验阳性，氧化酶、触酶、硝酸盐均为阳性，吲哚为阴性。质控菌株为铜绿假单胞菌 ATCC 27853。2012年6月以前菌株未鉴定到种；6月之后的5株菌经VITEKⅡ鉴定为马尔他布鲁菌（Bruc.melitensis 97%），鉴定编码100000130020100。对于血液、组织或无菌体液来源的阳性培养物，若该菌在血平皿上的菌落是小菌落、麦康凯平皿上不生长，氧化酶和触酶为阳性，吲哚试验为阴性，有上述生化反应特征，且2 h内尿素水解试验为阳性的微生物应被推定为布鲁菌，并应立即采取生物恐怖预防措施［4］。

结 果

绝大多数细菌是以二分裂方式繁殖，所以可以将生长和繁殖的整个过程分为迟缓期、对数生长期和稳定期［5］。繁殖速度快的菌种一般迟缓期较短，繁殖速度慢的菌种一般迟缓期较长。图1a为本实验室培养出金葡菌生长曲线，葡萄球菌属细菌生长期曲线有一定的倾斜可见迟缓期、对数生长期及稳定期3个阶段，生长期曲线角度较大；图1b是本实验室培养出布鲁菌生长曲线，布鲁菌迟缓期曲线较平坦，3 d左右阳性报警，生长期曲线短，稳定期曲线平坦；图1c是本实验室培养出大肠埃希菌生长曲线，肠杆菌科细菌迟缓期较短，生长期生长迅速，甚至无稳定期。

图1 血培养葡萄球菌、布鲁菌、肠杆菌科细菌生长曲线Figure 1 The characteristic growth curves of Staphylococcus aureus，Brucellaand E.coli in blood culture

讨 论

布鲁菌的生长曲线不同于肠杆菌科细菌、葡萄球菌，与不发酵糖革兰阴性杆菌生长曲线相同。李新等［6］报道，不发酵糖革兰阴性杆菌在血培养仪上生长曲线的特点是：生长期所对应的纵轴较短，迟缓期和稳定期曲线较平坦，阳性报警时间均值18.8 h。陈日荣等［7］观察肠杆菌科细菌、葡萄球菌、不发酵糖革兰阴性杆菌、链球菌属细菌、肠球菌属细菌及真菌的生长曲线，结果与李新等报道的相同，阳性报警时间均小于24 h。本院分离的15株布鲁菌在Bact／Alert 3D血培养仪上的生长曲线与不发酵糖革兰阴性杆菌的特点相同，阳性报警时间均值63.9 h，只有1株菌在36 h出现生长期，较其他14株菌生长期出现早。由此可见布鲁菌的生长曲线特点虽然与不发酵糖革兰阴性杆菌相同，但阳性报警时间较晚。有研究表明，在布鲁菌流行地区使用血培养仪监测系统，大部分布鲁菌在3 d内可获得阳性结果［8］。内蒙古自治区是布鲁菌病流行地区，本研究中15株布鲁菌均在3 d左右检出。如出现上述生长曲线时，应高度怀疑为布鲁菌，后续的操作都应在生物安全柜中进行，转种的平皿要延长培养时间，因大多数布鲁菌在血平皿及巧克力平皿上需要48～72 h以上才能生长出肉眼可见的菌落。注射器抽取血培养瓶中液体直接进行尿素水解试验，结合涂片革兰染色细菌形态特点或柯氏染色可以提示布鲁菌生长，比从平皿选取菌落进行上述试验提前24～48 h。

用布鲁菌诊断血清即可确定布鲁菌，但不能鉴定到种。在选用治疗药物时可根据鉴定到属的结果。鉴定到种和生物型水平有助于流行病学研究。通常不推荐进行布鲁菌药物敏感试验，大多数布鲁菌病治疗失败并非由于细菌耐药［9］。

布鲁菌侵袭力较强，可以通过黏膜、完整皮肤、呼吸道感染人类，在体内有很强的繁殖和扩散能力。由于布鲁菌对人有极强的致病力，常可导致实验室获得性感染，被认为是潜在的生物恐怖病原菌，气溶胶是实验室获得性感染的主要原因。实验室感染可能与未在生物安全柜内处理阳性血培养标本有关。国外文献有实验室暴发感染的相关报道［10－11］。我国近年也有实验室感染布鲁菌的相关报道［12－13］。因此，必须严格遵守实验室安全操作规程，处理感染性材料时，特别是处理布鲁菌等具有高度传染性的标本时，需要在3级生物安全防护下进行操作。实验室工作者应认识到气溶胶传播的危险，适当使用生物安全防护，降低实验室获得性感染的风险。

［1］ 刘锡光.现代诊断微生物学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：530.

［2］ 沈定霞.布鲁菌感染的临床特性及实验室检测［J］.中华检验医学杂志，2012，35（1）：8－9.

［3］ 陈东科、孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱［M］.北京：人民卫生出版社，2011：80.

［4］ CLSI.Abbreviated Identification and Bacteria and Yeast；Approved Guideline－Second Edition［S］.CLSI document M35－A2.Wayne，PA：Clinical and Labomtory Standards Instiute，2008.

［5］ 张颖悟，蓝宏泰，郑家齐.临床微生物学［M］.大连：大连出版社，1990：21－28.

［6］ 李新，焦连亭，康淑荷，等.细菌在血培养仪上生长曲线的特点分析［J］.江西医学检验，2003，21（4）：229－232.

［7］ 陈日荣，李惠冰，周美容.不同种类微生物在全自动血培养仪中的生长曲线特点及其意义［J］.中国感染控制杂志，2006，5（3）：206－208.

［8］ CLSI.Principles and Procedures for Blood Cultures；Approved Guideline［S］.CLSI document M47A.Wayne，PA：Clinical and Labomtory Standards Instiute，2007.

［9］ 徐建国，梁国栋，邢来君，等主译.临床微生物学手册［M］.北京：科学出版社，2005：892.

［10］ Robichaud S，Libman M，Behr M，et al.Prevention of laboratory－acquired brucellosis［J］.Clin Infect Dis，2004，38（12）：e119－e122.

［11］ Fiori PL，Mastrandrea S，Rappelli P，et al.Brucella abortus infection acquired in microbiology laboratories［J］.J Clin Microbiol，2000，38（5）：2005－2006.

［12］ 张海艳，马立宪，周艳丽.一例实验室感染布鲁氏菌病病例的流行病学调查［J］.首都公共卫生，2008，2（1）：38－39.

［13］ 王帝，翟璐.东北农业大学28名师生因动物实验感染严重传染病［N］.中国青年报，2011－09－03.