柳树液泡膜ATP酶B亚基基因克隆及在盐胁迫下的表达分析

李 敏，张 健，冯立国，李玉娟，冯新民，王 莹，李婷琳

(江苏沿江地区农业科学研究所，江苏 如皋 226541;2.扬州大学园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009)

植物液泡膜H+-ATPase的结构是V型的，在逆 境应答中的功能早已被关注，其分子质量为400000～650000，由7～10个亚基组成，分为亲水的V1亚基组和疏水的 V0亚基组［1］。V1由 A、B、C、D、E、F、G和H亚基组成，主要是催化ATP水解;而V0由a、c、c'、c″、d 和 e 亚基组成，主要是跨内膜形成质子通道［2］。多数研究表明，盐或干旱胁迫能诱导C3、C4植物的V型H+-ATP酶的含量、活性和结构发生变化，尤其以兼性C3/CAM植物冰叶日中花(Mesembry-anthemum crystallinum)最为典型，在NaCl胁迫时，该植物的液泡膜H+-ATPase活性增加了7倍多［3］，说明V型H+-ATP酶是植物对逆境应答的敏感位点。

柳树(Salix viminalis L.)为杨柳科柳属落叶乔木或灌木，生长速度快，是优良的园林绿化树种［4-5］。近年来，江苏沿江地区农业科学研究所开展了耐盐柳树的选育工作，并选育出了一系列耐/敏盐柳树无性系。与普通柳树相比，耐盐柳树具有较强的耐盐碱性，能在含盐量4.0‰左右、pH值10.4的土壤中正常生长，是中国极具潜力的沿海滩涂造林树种［6］，这些耐盐柳树资源为开展柳树耐盐机理研究提供了极好的试材。目前，有关柳树泡膜ATP酶B亚基基因(VHA-B)的克隆及盐胁迫表达方面的研究较少，本试验拟以课题组选育出的耐盐柳树L0911无性系为试材，通过克隆获得VHA-B基因，并分析其在盐胁迫下的表达情况，为进一步开展植物抗逆性基因工程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试材为江苏沿江地区农业科学研究所选育出的耐盐柳树L0911无性系，该品系是2009年5月在江苏如东东凌沿海垦区种植的竹柳林下发现的幼苗，乔木，速生，新枝红褐色，老枝灰紫色，观赏性强。2009年秋天开始对L0911进行微体快繁，2011年对几种柳树进行水培盐试验，发现低浓度盐对L0911茎高和根长的生长有一定促进作用，0.5%以上盐浓度才在一定程度上抑制其生长，其耐盐性明显高于普通柳树［7］。2010～2012年分别在大丰、启东、海门、如皋等地种植，经过近3年的试验观察，L0911表现出适应性强、耐盐碱性能好、观赏性强、速生性明显等优势。

L0911无性系采用0.5×Hoagland营养液水培，选择生长健壮的幼苗(水插30 d，苗高12 cm，叶片数10张左右)用200 mmol/L NaCl溶液分别处理0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，取新鲜嫩叶片。另外将L0911幼苗分别用 0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl溶液处理48 h，取新鲜嫩叶片，用液氮速冻，并保存于-70℃冰箱待用。

1.2 试验试剂

引物的合成、Taq DNA聚合酶、dNTP(10 mmol/L)、DNA marker和 PCR产物纯化回收试剂盒(SK1141)、质粒提取试剂盒(SK1191 UNIQ-10)、荧光定量PCR用试剂盒(SK8661)、常规化学试剂等均购自上海生工生物工程有限公司。pMD18-T载体购自大连宝生物(TaKaRa)。

1.3 RNA提取和总cDNA的合成

采用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)，并参照试剂说明手册提取总 RNA。总 cDNA的合成用AMV逆转录酶(BBI公司产品)并按照反转试剂盒说明书进行。

1.4 柳树L0911的VHA-B基因的克隆

以毛果杨(Populus trichocarpa)VHA-B设计了引物VHA-B F1:5'-CTCGCTGTGTACCAGAGCCAG-3';VHA-B R1:5'-TCAACTTCTTATAGCTCATAGA-3'。以L0911叶片总cDNA为模板，PCR产物经1%琼脂糖电泳后，切胶回收，并进行 T/A克隆(pMD18-T)。阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。所得克隆序列为2次独立PCR和3个以上质粒测序的结果。

1.5 氨基酸序列分析和系统进化树构建

用BLAST程序软件从GenBank中筛选15个来源于不同物种VHA-B基因编码的氨基酸序列，分别是:杨树(Populus trichocarpa，XP_002305533)、水稻(Oryza sativa ssp.japonica，Os01g0711000)、拟南芥(Arabidopsis thaliana，NP_974707)、冰叶日中 花(Mesembryanthemum crystallinum，CAD27443)、盐爪爪(Kalidium foliatum，ABK91686)、苜蓿(Medicago truncatula，EF153483)、盐穗木(Halostachys caspica，ABO45932)、碱蓬(Suaeda salsa，AAO73463)、小麦(Triticum aestivum，ABN54974)、玉米 (Zea mays，NM_001159193)、 烟 草 (Nicotiana tabacum，AAF26445)、伞藻属蝶状藻(Acetabularia acetabulum，BAA09099)、蚂 蚁 (Harpegnathossaltator，EFN82772)、棉 铃 虫 (Helicoverpa armigera，ADK94761)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster，NP_476908)。利用 DNA MAN软件将这些序列与L0911的VHA-B基因编码的氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。

1.6 实时荧光定量PCR分析L0911 VHA-B基因盐胁迫处理的响应

根据测序结果，设计引物VHA-B F2(5'-TAGCTGCTCAAATATGTCGCC-3')和VHA-B R2(5'-GCCAAGTTTAGAAAGAGGGTCAC-3')，对 L0911 VHA-B基因盐胁迫处理后的响应进行分析。用ubiquitinlike(UBQ-L)为内参基因［8］，引物为 UBQ-L-F(5'-TGAGGCTTAGGGGAGGAACT-3')和UBQ-L-R(5'-TGTAGTCGCGAGCTGTCTTG-3')。将上述盐处理的柳树L0911幼苗按1.3方法进行总RNA提取以及cDNA合成。按模式植物总RNA抽提纯化试剂盒(SK8661)操作配制PCR体系，于ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行定量PCR检测，3次重复，测定其 Ct值，用 F=2-△△Ct公式［9］计算出样品间目的基因的表达量差异。

2 结果

2.1 柳L0911 VHA-B基因的克隆

用毛果杨(Populus trichocarpa)PtVHA-B基因设计的引物F1和R1能在柳L0911的cDNA模板中成功扩增(图1)，且长度大小符合预期。进一步通过克隆测序后分析表明，L0911 VHA-B基因cDNA全长1566 bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框(1467 bp)、终止密码子、5'非编码区(41 bp)和3'非编码区(58 bp)，共编码518个氨基酸。这与测序结果一致，表明已成功获得该基因的全长cDNA序列。在GenBank通过NCBI同源性搜索，比对显示该序列编码的氨基酸序列与杨树、水稻、小麦、拟南芥、烟草、冰叶日中花、碱蓬、盐爪爪的相应基因编码氨基酸序列一致性达到95.88%，说明该基因属于VHA-B家庭成员。

图1 引物VHA-B F1/R1扩增的PCR产物Fig.1 Agarose gel electrophoretic analysis of PCR product of VHA-B using VHA-B F1/R1

2.2 蛋白质序列系统进化分析

耐盐柳树L0911 VHA-B基因编码蛋白质长度为487个氨基酸，分子量为54040，等位点是4.61。采用DNA MAN软件对L0911 VHA-B基因进行系统发育分析，结果见图2，可以看出，本研究获得的柳树L0911的VHA-B基因与杨树位于相同分支，相似性最高，达到97%，与拟南芥、冰叶日中花、苜蓿、盐爪爪、盐穗木、碱蓬、小麦、玉米、烟草相似性也较高，达到90%以上，与伞藻属蝶状藻相似性达到80%以上，与蚂蚁、棉铃虫、黑腹果蝇相似性达到75%以上。图中显示了高等植物、低等植物和昆虫各聚为一类，说明液泡膜VHA-B基因进化与生物学进化一致。从图中不同种类氨基酸序列分析，VHA-B亚基的保守性较高，并且在长期的进化过程中，VHA-B亚基逐步适应环境演变。

2.3 盐胁迫下L0911 VHA-B基因的表达分析

2.3.1 不同浓度NaCl溶液相同时间胁迫下的表达特性 柳L0911幼苗经不同浓度的NaCl溶液胁迫处理48 h，提取叶片总RNA，反转录后进行荧光定量PCR，并进行溶解曲线分析，所得溶解曲线呈现单峰可进行数据分析。

以未进行NaCl胁迫处理48 h的叶片中BADH基因的表达量为对照，将实时荧光定量中得到的目的基因L0911 VHA-B和内参基因UBQ-L的平均Ct值，代入 F=2-△△Ct公式进行计算并作图，得到图3。从图3可以看出L0911叶片中VHA-B基因的表达量随着盐浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，在200 mmol/L NaCl胁迫下表达量最高，为对照的2.64倍。说明一定浓度的 NaCl胁迫可以诱导L0911的VHA-B基因表达量的增加，但盐浓度达到300 mmol/L，胁迫48 h时VHA-B基因表达量下降。

2.3.2 相同浓度NaCl溶液不同时间胁迫下的表达特性 用200 mmol/L NaCl溶液处理L0911幼苗，分别在 0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 提取叶片的总RNA，反转录后进行荧光定量PCR分析。以未经NaCl胁迫处理的叶片中VHA-B基因的表达量为对照，将目的基因VHA-B和内参基因UBQ-L的平均Ct值代入公式F=2-△△Ct进行计算并作图，得到图4。从图4可以看出，随着盐胁迫时间的延长，叶片中VHA-B基因表达量呈现先升高后降低的趋势，在盐胁迫72 h时达到峰值，为对照的3.46倍，说明盐胁迫能诱导该基因表达量的增加。随着时间进一步延长，在96 h时叶片中该基因的表达量开始下降，为对照组的2.02倍。

图2 基于VHA-B蛋白不同物种的进化树Fig.2 Phylogenetic analysis based on VHA-B proteins

图3 不同NaCl浓度处理后48 h L0911叶片中VHA-B基因表达Fig.3 Expression of VHA-B gene in the leaves of L0911 under different concentrations of NaCl stress for 48 h

图4 200 mmol/L NaCl处理不同时间L0911叶片中VHA-B基因的表达Fig.4 Expression of VHA-B gene in the leaves of L0911 under 200 mmol/L NaCl stress for different periods of time

3 讨论

液泡膜ATPase B亚基属于真核生物ATPase家族，是一个重要的不具备催化活性的调节亚基，定位在V1结构域［10］。本研究克隆了柳树 L0911的VHA-B基因，测序结果表明，L0911的VHA-B含有1个完整的开放阅读框架，核苷酸序列长为1566 bp，推测的氨基酸序列全长为518个氨基酸残基。氨基酸序列与杨树、水稻、拟南芥、冰叶日中花、碱蓬、盐爪爪等高等植物的相应氨基酸序列一致性达到95%。碱蓬和冰叶日中花的VHA-B蛋白功能已有报道［11-12］，推测L0911的VHA-B蛋白也具有该生物学功能。

当植物处于逆境条件下，液泡膜上的ATPase可以改变结构以适应环境的变化，从而得以存活。本试验用荧光定量的方法检测L0911在盐胁迫下，VHA-B基因mRNA的表达情况，结果表明，VHA-B基因是受盐诱导的，随着盐浓度的升高表达量增大，至盐浓度200 mmol/L时表达量最大，为对照的2.64倍;在同一盐浓度下，随着盐胁迫时间的延长，其表达量也增大，72 h时表达量是对照的3.46倍。Li等［11］的研究表明碱蓬(Suaeda salsa)从Northern及Western印迹上显示液泡膜H+-ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导。曾幼玲［13］的研究表明盐爪爪(Kalidium foliatum)的VHA-B基因随着NaCl胁迫浓度的增加表达持续增强，与本研究结果相似，说明L0911的VHA-B基因在一定时间内是受盐诱导的。

［1］罗以筛.盐胁迫下植物质膜和液泡膜H+-ATPase活性的研究进展［J］. 安徽农业科学，2012，40(3):1263-1265.

［2］朱家红，张全琪，蔡元保，等.巴西橡胶树液泡ATP酶F亚基基因克隆及表达［J］.西北植物学报，2009，29(6):1079-1083.

［3］张天宇，燕丽萍，夏 阳，等.柳树愈伤组织的诱导研究［J］.山东林业科技，2007(2):17-19.

［4］BINZEL M L，HESS F D，RAY A B，et al.Intracellular compartmentation of ions in salt adapted tobacco cells［J］.Plant Physiol，1988，86:607-614.

［5］张 健，李 敏，李玉娟，等.盐胁迫下3个柳树新品系生理指标的变化［J］.江苏农业科学，2012，40(8):197-199.

［6］解孝满，李景涛，刘建军，等.柳树无性系苗期试验分析［J］.山东林业科技，2008(3):44-45.

［7］李 敏，张 健，李玉娟，等.盐胁迫对不同柳树种质幼苗生长的影响［C］//中国林学会，南京林业大学.第十届中国林业青年学术年会论文集.南京:南京林业大学，2012:37-43.

［8］关亚丽.柳树AP3同源基因的克隆与表达分析［D］.南京:南京林业大学，2006.

［9］KENNETH J，LIVAK，THOMAS D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method［J］.Method，2001，25:402-408.

［10］XIA M，WANG X B，LI H B，et al.Identification of the rice vacuolar ATPase B subunit gene and its expression pattern analysis under phosphorus deficiency［J］.Acta Botanica Sinica，2002，44(5):573-578.

［11］LI P H，WANG Z L，ZHANG H，et al.Cloning and expression analysis of the B subunit of V-H+-ATPase in leaves of halophyte Suaeda salsa under salt stress［J］.Acta Botanica Sinica，2004，46(1):93-99.

［12］TSIANTIS M S，BARTHOLOMEW D M，SMITH J A C.Salt regulation of transcript levels for the c subunit of a leaf vacuolar H+ATPase in the halophyte Mesembryanthemum ctystallinum［J］.Plant J，1996，9(5):729-736.

［13］曾幼玲.盐爪爪和盐穗木的耐盐生理生化及耐盐相关基因的克隆与表达研究［D］.乌鲁木齐:新疆大学，2007.