2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗与视黄醇结合蛋白4的相关性

朱丽丽 于 健 苏 珂 胡 璟 何永玲

(桂林医学院附属医院内分泌科，广西 桂林 541001)

胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的病理生理基础，也是其发病的始动因素，贯穿于T2DM的发生、发展全过程，如何改善IR成为治疗糖尿病的关键环节之一。目前发现脂肪组织是一个活跃的内分泌器官，通过分泌大量的脂肪细胞因子参与糖、脂代谢调节的过程，主要有抵抗素、白介素-6、肿瘤坏死因子-α、瘦素等，脂肪细胞因子与IR存在密切联系〔1〕。视黄醇结合蛋白4(RBP4)作为一种近年被证实的与肥胖诱导的IR相关的脂肪细胞因子，在T2DM发病机制尤其是IR中受到广泛关注〔2〕。本研究拟通过观察血清RBP4在T2DM大鼠IR的水平，进一步探讨血清RBP4与IR及脂代谢的关系及相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠30只，10周龄，体重200～220 g，由桂林医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号为:SCXK(桂)2007-0001，在桂林医学院SPF级实验动物中心饲养，每笼4～5只，室温控制在(22±2)℃，相对湿度控制在40% ～60%，明暗周期为12 h(8 am～8 pm)，均自由取食饮水。

1.2 实验试剂及设备 注射用链脲佐菌素由美国Sigma公司提供;血清RBP4(大鼠)检测试剂盒由上海蓝基公司提供;胰岛素(大鼠)试剂盒购自美国Beckman Coulter Inc公司;3-15型台式低速离心机由德国Sigma公司提供;7600型全自动生化分析仪由瑞士罗氏公司提供;血糖检测由瑞士罗氏公司卓越型快速血糖仪及血糖试纸提供。

1.3 饲料 普通饲料由桂林医学院实验动物中心提供;蛋黄粉、猪油、白糖均自备;高脂饲料配方:普通饲料60%、猪油17%、白糖20%、蛋黄粉3%，上述成分均匀混合，重新压制成形。

1.4 方法

1.4.1 动物模型建立与分组 以高脂高糖饲料喂养加小剂量链脲佐菌素(STZ)左下腹腔注射(ip)的方法建立T2DM大鼠IR模型。将30只SD大鼠适应性饲养1 w后，随机分为正常对照组15只、模型组15只。正常对照组给予普通饲料喂养，模型组给予高糖高脂饲料喂养，连续8 w。每日添食、换水一次，观察大鼠的皮毛、色泽、精神状态、食欲、尿量等一般情况，每周固定时间测量大鼠血糖、体重。8 w末，所有大鼠隔夜禁食12 h，自由饮水，正常对照组给予1次性ip 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液30 mg/kg，模型组给予1次性 ip 1%STZ溶液30 mg/kg(STZ溶于0.1 mol/L柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中，pH 4.2)。正常对照组继续普通饮食，模型组继续高糖高脂饮食72 h后检测随机血糖，以连续2次随机血糖≥16.7 mmol/L作为T2DM大鼠模型成功判定标准〔3〕，模型组共有12只大鼠造模成功，两组大鼠饮食同前，继续喂养4 w。

1.4.2 指标检测

1.4.2.1 一般情况 观察毛色、神态、精神、体重等，记录动物死亡情况。

1.4.2.2 生化指标测定 12 w末，实验结束时，所有大鼠禁食12 h，于次日8时断尾采血，罗氏血糖仪检测空腹血糖(FBG)，再予10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，腹主动脉采血8 ml，3 000 r/min离心 10 min，收集血清，从中取 1.5 ml血清置－20℃冰箱保存，以备RBP4的检测。采用全自动生物化学分析仪测定血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量，采用自动化学发光免疫分析仪测定空腹胰岛素(FINS)。胰岛素抵抗采用稳态模式评估法:胰岛素敏感指数(ISI)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，公式:ISI=Ln〔1/(FBG×FINS)〕，HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.4.2.3 RBP4的测定 血清RBP4用酶联免疫吸附法测定:取出酶标板，每孔各加入标准品或待测样品100μl，再在各孔中加入50μl酶结合物溶液，混匀，将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育1 h，充分洗涤酶标板5次，用吸水纸彻底拍干，各孔中加入显色剂100μl，25℃避光反应15 min，最后各孔加入终止液50μl，终止反应，30 min内在波长450 nm的酶标仪上读取各孔的吸光度(A值)处吸光值，用标准物的浓度与A值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的A值代入方程式，计算出各样品RPP4的浓度。

1.5 统计学分析 用SPSS19.0软件进行分析，正态分布数据采用x±s表示，同一时间点两组间比较采用独立样本t检验，同一组内不同时间点的比较采用重复测量方差分析，血清RBP4水平与各变量间的关系采用Pearson分析和多元逐步回归分析。

2 结果

2.1 两组大鼠一般情况的比较 实验开始后的8 w内两组大鼠摄食量基本持平，大鼠的活跃程度和毛色光亮无明显变化，8 w后，模型组大鼠较正常对照组大鼠逐渐出现精神萎靡、毛发粗糙发黄无光泽、多饮、多食、多尿、消瘦等表现。实验期间正常对照组大鼠死亡1只，模型组大鼠3只造模不成功。

2.2 两组大鼠体重的比较 同一时间点与正常对照组相比，除实验开始时，前8 w的模型组大鼠体重均显著增加，差异有统计学意义(P＜0.01);造模后模型组大鼠体重较正常对照组显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。正常对照组大鼠在实验期间体重一直呈显著的增长趋势，模型组大鼠在前8 w体重亦呈明显的增长趋势，在8 w后体重较前显著下降的趋势，两组大鼠喂养不同时间点体重差异有统计学意义(F=819.836，P=0.000)，饲料干预和体重之间存在交互效应(F=78.727，P=0.000)。见表 1。

2.3 两组大鼠实验指标的比较 建模开始时两组大鼠断尾测FBG，正常对照组为(4.92±0.60)mmol/L，模型组为(5.19±0.86)mmol/L，两组大鼠建模初空腹血糖比较无统计学意义(P ＞0.05)。实验结束时，模型组大鼠 FBG、FINS、TG、TC、LDLC、HOMA-IR水平及RBP4水平均明显高于正常对照组大鼠，ISI低于正常对照组大鼠(P＜0.05，P＜0.01)。见表2。

表2 两组大鼠RBP4水平及实验指标比较(x±s)

2.4 血清RBP4与其他指标的相关性 简单相关分析显示，模型组大鼠血清RBP4与FINS(r=0.453，P＜0.05)、FBG(r=0.816，P ＜ 0.01)、TG(r=0.733，P ＜0.01)、TC(r=0.699，P ＜0.01)、LDL-C(r=0.747，P ＜ 0.01)、HOMA-IR(r=0.817，P ＜0.01)正相关，与ISI(r=－0.770，P＜0.01)负相关。进一步以血清 RBP4 为因变量，以 FINS、FBG、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR和ISI为自变量进行多元逐步回归分析，结果显示，HOMA-IR是血清RBP4独立影响因素(r2=0.668，β=0.237，P＜0.01)。

3 讨论

IR指胰岛素作用的靶器官(主要是肝脏、肌肉和脂肪组织)对胰岛素作用的敏感性降低，从而导致机体产生一系列病理变化，进而演变为T2DM。本研究首先为准确建立2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型，采用国内外公认的T2DM建模方法〔4〕。有研究表明长期高糖饮食，加重胰岛分泌胰岛素的代谢负荷，对于糖尿病前期或糖尿病人群均有不利的影响〔5〕。另外，未经过提炼的动物油脂可降低胰岛素敏感性，诱发IR。本研究在基础饲料的基础上加用白糖、猪油和蛋黄粉持续喂养8 w后，模型组大鼠出现了肥胖、胰岛素抵抗的特点，在此基础上再予腹腔注射小剂量STZ后，大鼠的血糖急剧升高，提示大鼠胰岛功能受到高糖高脂诱导的IR和STZ的破坏后，胰岛功能受到损伤。实验结束时，模型组大鼠出现明显的精神萎靡、毛发粗糙、多饮、多尿、消瘦等表现，且FBG、HOMA-IR水平均明显高于正常对照组，ISI明显低于正常对照组，表明T2DM大鼠IR模型建立成功。

由GLUT4介导的葡萄糖跨膜转运是脂肪和肌肉等组织利用葡萄糖的限速步骤。Yang等〔6〕学者发现，敲除了小鼠体内的Glut4基因后，在小鼠的肌肉和肝脏部位出现对胰岛素的抵抗性。利用 DNA芯片技术发现，adipose-Glut4-/-型小鼠血清RBP4水平明显升高，提示RBP4可能参与IR的发生。本研究发现，糖尿病组大鼠血清RBP4水平显著高于正常对照组，相关分析显示RBP4与FBG、FINS及HOMA-IR呈正相关，与ISI成负相关;多元逐步回归分析显示，HOMA-IR为RBP4的独立影响因素，进一步证实了RBP4与IR的密切相关性。RBP4致IR的机制可能为:①Yang等〔6〕发现RBP4抑制肌肉组织磷脂酰肌醇3激酶的活性，抑制胰岛素受体底物-1的磷酸化，使肌肉组织摄取葡萄糖减少;②RBP4诱导肝细胞表达磷酸烯醇式丙酮酸激酶不仅促进基础状态糖异生，同时又可降低胰岛素抑制肝糖输出的作用，从两方面共同作用导致组织表现为IR;③此外，张黎军等〔7〕研究发现 RBP4可能通过增强机体氧化应激参与IR。

脂质代谢紊乱为糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管病变等IR相关疾病发生发展的前期因素。新近研究发现RBP-4不仅参与糖代谢调节，而且与脂质代谢密切相关，尤其TG〔8〕。张博等〔9〕研究发现血清RBP4可能通过增强血管内膜氧化应激并影响血脂代谢。本研究提示RBP4可能参与了T2DM患者的脂代谢紊乱，并参与了IR相关疾病的发生发展。综上所述，本研究成功制作T2DM大鼠IR动物模型，模型组大鼠血清RBP4水平显著升高，相关分析显示 RBP4与HOMA-IR正相关，且HOMAIR为RBP4的独立影响因素，这为RBP4与IR之间存在密切关系提供新的支持。RBP4可能通过多种途径直接或间接参与IR的发生发展，进而增加糖尿病的发病风险，这为我们治疗IR相关疾病提供一个新思路，即可以通过对RBP4进行早期干预，从而阻止或延缓糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝、代谢综合征、心血管疾病等IR相关疾病的发生和发展。

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3 王保伟，李 颖，刘晓红，等.高脂饲料喂养时间及链脲佐菌素剂量对实验型2型糖尿病大鼠造模的影响〔J〕.卫生研究，2011;40(1):99-102.

4 Reed MJ，Meszaros K，Entes LJ，et al.A new rat model of type2 diabetes:the fat-fed，streptozotocin-treated rat〔J〕.Metabolism，2000;49(11):1390-4.

5 Schulze MB，Schulz M，Heidemann C，et al.Carbohydrate intake and incidence of type 2 diabetes in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition(EPIC)-Potsdam Study〔J〕.Br J Nutr，2008;99(5):1107-16.

6 Yang Q，Graham TE，Mody N，et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes〔J〕.Nature，2005;436(7049):356-62.

7 张黎军，黄从新，郝亚荣，等.胰岛素抵抗大鼠视黄醇结合蛋白4骨骼肌磷脂酰肌醇3激酶的表达及吡格列酮的干预作用〔J〕.中华老年医学杂志，2011;30(9):774-8.

9 Hermsdorff HH，Zulet MA，Puchau B，et al.Association of retinol-binding protein-4 with dietary selenium intake and other lifestyle features in young healthy women〔J〕.Nutrition，2009;25(4):392-9.

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