降钙素对兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡及相关基因的影响

尤笑迎 杨红梅

(郑州人民医院骨科，河南 郑州 450003)

膝骨性关节炎(KOA)是以滑膜和关节软骨结构破坏和功能障碍为主要病理改变的慢性退行性骨关节疾病，是导致关节疼痛、畸形的主要原因，严重影响老年人的生活质量，研究发现其发生、发展与软骨细胞的凋亡有关〔1〕。本实验通过建立不稳定膝关节诱导骨性关节炎模型，观察了降钙素对KOA发病过程中关节软骨细胞凋亡和相关基因的影响，从而探讨降钙素治疗KOA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 鲑鱼降钙素(1 ml:50 U/支，H20050501，北京诺华制药有限公司);生物显微镜(日本，OLYMPUS);TUNELL检测试剂盒(上海锐聪科技发展有限公司);bcl-2免疫组化试剂盒(武汉博士德生物制剂有限公司)。

1.2 模型制备及实验分组 4～6月龄健康大耳白兔36只，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不限，随机分为空白对照组(A组)、模型组(B组)、降钙素治疗组(C组)，每组12只。B、C两组采用改良Hulth法复制膝骨性关节炎，经耳缘静脉缓慢推注50%乙醇(5 ml/kg)进行麻醉，左下肢膝关节及周围备皮、消毒，取膝关节内侧入路，切断内侧副韧带，摘除内侧1/3半月板，切断前交叉韧带，避免损伤关节软骨，缝合关节囊及皮肤，A组除切开皮肤和关节腔外，不做其他处理。术后连续7 d青霉素20万U肌肉注射，分笼饲养，1 w后开始每天强迫活动1 h，连续4 w，从术后第6周开始C组每天皮下注射降钙素5 U/kg，A、B组给予等量生理盐水皮下注射。

1.3 软骨标本的制备 实验结束后，经耳缘静脉空气栓塞处死动物，立即切开膝关节腔，用锐利刀片切取股骨内髁关节软骨，修成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，经冰生理盐水冲洗后置入4%多聚甲醛液(pH 7.4)固定72 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙12周，石蜡包埋，常规切片备用。

1.4 检测指标

1.4.1 软骨组织大体形态观察 动物处死后，打开关节腔，观察膝关节关节囊、滑膜、关节软骨及关节液是否清澈，按Pelletier JP标准进行评分，0分:关节面透明光整、色泽正常;1分:关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗;2分:关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表层和中层;3分:关节面有溃疡，缺损深达软骨深层;4分:软骨剥脱，软骨下骨质暴露。

1.4.2 显微镜下观察 切片进行常规HE(苏木素-伊红)染色，显微镜下观察软骨形态变化，并参照Mankin改良的关节软骨病理评分标准进行积分统计。

1.4.3 软骨细胞凋亡情况检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位末端平移法(TUNEL)检测软骨细胞的凋亡情况，严格按试剂盒说明书进行操作。光镜下以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片随机选取5个不重叠高倍视野，计算阳性细胞百分数。

1.4.4 软骨组织bcl-2蛋白表达情况检测 采用免疫组织化学染色法进行，严格按试剂盒说明书进行操作，用PBS代替一抗作为阴性对照，阳性结果为软骨细胞质呈棕褐色或棕黄色颗粒，HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统(同济千屏)测定阳性细胞的灰度值，取每张切片均值作为测量值。

1.5 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件包进行统计分析，计量资料以x±s表示，用 t检验。

2 结果

2.1 一般情况 造模过程中，动物良好无死亡，术后膝关节感染2只，均被淘汰，列入观察的共34只，A组11只，B组11只，C组12只，余动物实验期间健康状况良好。术后3～5 d膝关节肿胀较明显，关节腔积液，双后肢力量减低，活动频次减少，1 w后逐渐好转，B、C组动物膝关节不稳，有异常活动度，4 w后膝关节畸形肿大，A组关节外部结构正常，无肿胀，活动自如。

2.2 大体形态观察 A组关节软骨半透明状，外观呈蓝白色，色泽明亮，无裂纹及软化，关节液清亮透明，滑膜无增生;B组关节软骨失去原有光泽，表面粗糙，呈灰黄色，有软骨缺损，尤以股骨内髁明显，滑膜不同程度增生粘连，关节液增多、混浊，呈泡沫状;C组关节软骨色泽变淡，光泽度降低，滑膜可见少量增生，关节液略增多。各组股骨髁软骨退变评分见表1。

表1 各组股骨髁软骨退变分级(n)

2.3 光镜观察结果 A组关节软骨4层结构清晰可辨，软骨面平滑规整，结构正常无裂隙，软骨细胞排列整齐，未见软骨细胞簇，基质均匀，潮线完整;B组软骨表层变薄、粗糙，裂隙较多，有软骨细胞簇集现象，潮线多不完整或消失;C组软骨4层结构可辨，软骨表面较规则、裂隙少，软骨细胞排列较整齐，潮线尚完整，见图1，Mankin评分见表2。

图1 各组关节软骨光镜观察结果(HE，×200)

2.4 软骨细胞凋亡及bcl-2蛋白表达情况检测结果 A组偶见软骨细胞凋亡，B组软骨全层可见大量凋亡的软骨细胞，C组软骨细胞凋亡情况介于前两者之间。见图2和表2;bcl-2蛋白表达情况见图3和表2。

表2 各组Mankin评分、软骨细胞凋亡及bcl-2蛋白表达情况(x±s)

图2 各组关节软骨细胞凋亡情况(TUNELL法，×200)

图3 各组关节软骨细胞bcl-2表达情况(DAB，×200)

3 讨论

细胞凋亡是生理或病理情况下，通过基因调控的细胞死亡形式之一。研究发现正常关节软骨中有细胞凋亡的发生，认为正常软骨中发生凋亡现象是细胞生长与分化过程中的一种生理现象，另有研究发现软骨细胞的凋亡过度是关节软骨退变发展成骨关节病的重要原因，关节软骨的细胞凋亡参与了骨关节炎的发病〔2〕。细胞凋亡受基因的调控，bcl-2是抑制细胞凋亡的重要基因，Erlacher等〔3〕在转录和蛋白水平研究OA患者及健康成人关节软骨中bcl-2的表达发现，OA患者bcl-2 mRNA表达水平较高，邻近软骨缺损区的软骨细胞高表达bcl-2蛋白，认为机体通过上调Bcl-2表达保护软骨细胞免遭凋亡。

本实验采用Hulth法复制动物OA模型，通过改变膝关节生物力学状态以诱导关节软骨退变，建立骨关节炎模型，通过Pelletier JP软骨组织大体评分和改良的Mankin关节软骨病理评分进行严格评价，发现与A组相比较，B组JP和Mankin评分明显升高，而此两种评分是反映骨关节炎病变严重程度的定量分析方法，病变越重，分值越大，积分越高，说明软骨损伤越严重，因此该实验结果表明B组动物膝关节软骨破坏严重，同时软骨细胞凋亡百分数和bcl-2表达均明显升高(P＜0.05)，与Lin等〔4〕研究结果一致，说明本实验KOA动物模型复制成功，且软骨细胞凋亡参与了KOA发病过程，而bcl-2表达的增多则可能是KOA过程中机体自身的一种保护机制。

降钙素是一种抗再吸收药物，长期以来一直用于治疗骨质疏松，且证实了其治疗骨量减少疾病的有效性和安全性，并且可影响OA关节损伤的进程〔5，6〕。本研究提示CT对KOA具有治疗作用，可减轻关节软骨的损伤;同时发现，与B组相比，软骨细胞凋亡百分数明显减少，而bcl-2表达则进一步明显升高(P＜0.05)，说明降钙素可能通过上调bcl-2的表达调控软骨细胞异常凋亡，而达到治疗KOA的作用，至于其具体的信号转导途径有待进一步研究。

1 Ryu JH，Shin Y，Huh YH，et al.Hypoxia-inducible factor-2α regulates Fas-mediated chondrocyte apoptosis during osteoarthritic cartilage destruction〔J〕.Cell Death Differ，2011;211(10):1038-45.

2 Musumeci G，Loreto C，Carnazza ML，et al.Characterization of apoptosis in articular cartilage derived from the knee joints of patients with osteoarthritis〔J〕.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2011;19(2):307-13.

3 Erlacher L，Maier R，Ullrich R，et al.Differential expression of the pro-tooncogene bcl-2 in normal and osteoarthritic human articular cartilage〔J〕.Rheumatol，1995;22(5):926.

4 Lin MN，Liu XX，Wang SL，et al.Effect of OA knee pad on apoptosis genes Bcl-2 and p53 expression in articular cartilage cells of experimental knee osteoarthritis〔J〕.Zhongguo Gu Shang，2009;22(9):688-91.

5 Segovia-Silvestre T，Bonnefond C，Sondergaard BC，et al.Identification of the calcitonin receptor in osteoarthritic chondrocytes〔J〕.BMC Res Notes，2011;4(1):407-13.

6 Nielsen RH，Bay-Jensen AC，Byrjalsen I，et al.Oral salmon calcitonin reduces cartilage and bone pathology in an osteoarthritis rat model with increased subchondral bone turnover〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2011;19(4):466-73.