基因合成的奠基人——哈尔·戈宾德·科拉纳

郭晓强

讲师，解放军白求恩军医学院生化教研室，石家庄 050081

基因合成的奠基人
——哈尔·戈宾德·科拉纳

郭晓强

讲师，解放军白求恩军医学院生化教研室，石家庄 050081

科拉纳；遗传密码；基因合成；诺贝尔生理学或医学奖

1953年，沃森和克里克DNA双螺旋模型的提出标志着分子生物学的诞生，而1958年克里克提出中心法则，进一步阐述了 DNA发挥信息载体功能的机制。DNA中的遗传信息需要转换为蛋白质中的结构信息才可实现生物学功能，这其中涉及到一个关键问题，即DNA(或 RNA)中的碱基序列决定蛋白质中氨基酸序列的秘密，科学家将“碱基顺序决定氨基酸顺序”这一特性称为遗传密码。20世纪60年代，破译遗传密码成为当时分子生物学领域最迫切需要解决的重大问题之一。1961年，美国国立卫生研究院的科学家尼伦伯格(Marshall Warren Nirenberg)首先应用大肠杆菌无细胞体系确定了第一个遗传密码，即UUU编码苯丙氨酸[1]。1966年，所有 64种遗传密码全部破译成功，世界多位科学家为此做出了卓越贡献，有两位科学家发挥了关键性作用，除尼伦伯格外，另一位就是美国籍印度裔科学家哈尔·戈宾德·科拉纳(Har Gobind Khorana)[2]。

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哈尔·戈宾德·科拉纳(1922—2011)

1922年1月9日，科拉纳出生于印度旁遮普邦(Punjab)一个仅有100户左右的小村庄莱布尔(Raipur, 现属巴基斯坦)。科拉纳是家中的幼子，上面还有三个哥哥和一个姐姐，父亲是英国殖民政府的一位农业税收员，但收入微薄，因此家庭非常贫困。尽管并不富裕，但科拉纳父母意识到教育的重要性，鼓励孩子们努力学习，并尽他们所能为科拉纳等提供最好的学习环境。科拉纳的早期教育条件非常简陋，由村里一位乡村教师在一个室外教室(所谓教室也就是在大树下搭建的简易装置)讲课，在这种艰苦条件下科拉纳完成了自己的初等教育。随后，科拉纳在木尔坦(Multan)完成自己的高中教育，并顺利考入位于印度拉合尔(Lahore)的旁遮普大学。

1943年，科拉纳以优异成绩从旁遮普大学毕业，并获得理学学士学位(专业为化学)，两年后又获得硕士学位(专业为生物化学)。大学期间，科拉纳一直努力学习、刻苦钻研，取得卓越成绩，毕业后幸运获得印度政府奖学金，从而得以进入英国利物浦大学进行博士学习。在利物浦大学，科拉纳跟随导师比尔(Roger J. S. Beer)教授主要进行生物碱合成和细菌色素紫色杆菌素(violacein) 的结构研究，凭借这些成果于1948年获得有机化学博士学位，期间他还对核酸生物化学产生了浓厚兴趣。毕业后，科拉纳在既没有推荐信也没有推荐人的情况下只身来到瑞士苏黎士联邦理工学院(Federal Institute of Technology, ETH)，找到著名有机化学大师普雷洛格(Vladimir Prelog，1975年诺贝尔化学奖获得者)寻找博士后职位，普雷洛格在看过科拉纳博士期间研究工作后同意他留下，但是无法提供科研基金。在随后的11个月时间里，科拉纳居住在实验室，主要靠大米和未消毒牛奶为生，尽管如此，科拉纳与普雷洛格建立了长期的科研联系，认为是影响自己将来科学研究和思维的最伟大导师。当时，科拉纳对有机化学方面的进展缺乏详细的理解，因此花费大量时间在图书馆查阅德国有机化学方面的文献，偶然发现一种鲜为人知的合成试剂——碳二亚胺(carbodiiide)。这种试剂并未引起太多研究人员的注意，在英文文献中几乎找不到有关这种试剂的描述。尽管当时科拉纳也不知道这种试剂的具体用途，但在将来的研究中正是这种试剂为他的成功发挥了关键性的作用[3]。

核酸合成研究

1949年，科拉纳为了履行早期奖学金的要求而返回印度，但当时分区后的印度使科拉纳的家乡划归到了巴基斯坦，亲人也已失散，科拉纳不得不暂时住在新德里的叔叔家。科拉纳花了几乎一年时间在寻找着工作，但当时印度无法为他提供学术研究方面的职位，因此无果而终[4]。印度政府最终决定免除科拉纳履行奖学金的义务，与此同时科拉纳在一位教授推荐下获得英国剑桥大学托德爵士(Lord Alexander Todd，1957年诺贝尔化学奖获得者)提供的博士后职位。

1950年，科拉纳在亲戚东拼西凑买到船票情况下又只身回到英国，开始了进一步的科学研究。当时剑桥已成为蛋白质和核酸生物化学研究的国际中心，托德爵士刚刚阐明了DNA分子中核苷酸的化学连接方式，沃森和克里克于1953年提出DNA双螺旋结构，桑格于1955年阐明胰岛素的一级结构，这些进展都极大激发了科拉纳对生物大分子的研究兴趣。在剑桥大学，科拉纳开始将碳二亚胺应用于有机化学合成，如可激活多肽羧基端，可合成具有生物学活性的焦磷酸化合物等。

1952年，加拿大英属哥伦比亚大学研究委员会主任施勒姆(Gordon M. Shrum)访问了剑桥大学，并请求托德推荐一位化学家到温哥华开展学术研究，而科拉纳幸运地获得了这次机会。在温哥华，科拉纳研究内容较为自由，可开展自己喜欢的内容，一方面研究蛋白质结构，另一方面重点转向研究核酸基本单位核苷酸的化学合成。1954年，科拉纳应用碳二亚胺合成了二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)。在随后的时间里，科拉纳及同事又先后合成了一系列的核苷酸化合物，包括环核苷酸、非对称二核苷酸和另一些重要生物分子。最重大的进展是 1959年，科拉纳与莫法特(John G. Moffat)合作应用碳二亚胺为原料合成乙酰 CoA[5]。乙酰CoA是当时所知包含核苷酸的最复杂辅助因子，传统方法是从酵母中提取，不仅耗时且价格昂贵，而科拉纳化学合成的实现使乙酰CoA生产成本大大降低，从而有利于乙酰CoA的广泛应用，这项工作也使科拉纳获得了极高的国际声誉。

科拉纳在核苷酸生物合成方面的贡献也引来大量著名生物化学家的造访，如伯格(Paul Berg，1980年诺贝尔化学家获得者)、科恩伯格(Arthur Kornberg，1959年诺贝尔生理学或医学奖获得者)和肯尼迪(Eugene Kennedy)等，通过和这些科学家的沟通，科拉纳也及时获悉了生物化学方面的最新进展。1955年，科拉纳了解到奥乔亚(Severo Ochoa，1959年诺贝尔生理学或医学奖获得者)发现了多聚核苷酸磷酸化酶，而科恩伯格也正在进行DNA酶学方面的研究工作，这些成就都进一步激发科拉纳进行核酸合成方面的研究。

遗传密码解析

1960年，科拉纳加入美国威斯康星大学，成为酶学研究所的所长，1962年升任生物化学教授并于1964年成为Conrad A. Elvehjem生命科学讲座教授。1961年，尼伦伯格第一种遗传密码的破译促使许多科学家加入遗传密码的研究行列，科拉纳也是其中之一。科拉纳拥有自己独立的实验室和研究团队，前期研究使他拥有深厚的酶学知识背景、全面的核苷酸生物化学知识和娴熟的寡核苷酸有机合成经验，这些先决条件都为最终破译遗传密码提供了强有力的保证。科拉纳还是一位伟大的战略型科学家和成功的科研管理者，他详细制定了破译遗传密码的策略，组织多名博士后共同参与到这个重大科学问题的解决之中。

科拉纳将化学方法和酶学方法(DNA聚合酶和RNA聚合酶)有机结合来破译遗传密码，到 1964年合成了包含64种(因为是三联体密码，所有共有43= 64种)可能遗传密码组合的核苷酸链，以这些寡聚核苷酸为模板在体外进行多肽链的合成，根据合成出的多肽链中氨基酸顺序来确定遗传密码。科拉纳合成了一系列二核苷酸重复如多聚UC的多核苷酸链，该链只可能包含两种遗传密码，即UCU和CUC，而最终获得丝氨酸和亮氨酸交错排布的多肽，尼伦伯格研究小组已确定UCU为丝氨酸密码，因此CUC则对应亮氨酸密码。科拉纳还进一步合成了三核苷酸和四核苷酸重复的多核苷酸链，如UAC重复，则可能包含三种遗传密码UAC、ACU和CUA, 通过分析合成的多肽链中氨基酸顺序和相关进展最终确定了编码20种氨基酸的61种遗传密码。更为重要的是，科拉纳研究小组还发现，在四核苷酸重复的多核苷酸链中包含UAG、UGA和UAA时则只能合成二肽或三肽，无法生成更长的多肽链，从而确定这三种为终止密码(尼伦伯格方法无法确定终止密码)。到1966年，科拉纳小组最终破译了所有的遗传密码[6]。除破译遗传密码外，科拉纳还鉴定出多种遗传密码特征，如进一步提供直接证据说明遗传密码为三联体，RNA是 DNA到蛋白质信息传递的中介分子(即 RNA 是蛋白质合成模板)，RNA翻译过程中遗传密码的阅读方向；两个密码子之间既不存在间隔又不存在重叠(密码连续性)。

1968年，科拉纳和尼伦伯格以及霍利(Robert William Holley)由于“对遗传密码及其在蛋白质合成过程方面作用的解释”而分享该年度诺贝尔生理学或医学奖[7]。遗传密码的破译及功能的阐明使人们对DNA作用有了更为全面的理解，从而大大推动分子生物学的发展，这些工作还促进了临床的应用，许多遗传性疾病原来仅关心DNA变异，现在可在蛋白质水平上进行研究。基因功能最终由表达出的蛋白质来体现，因此遗传密码的破译使人们更好地理解了遗传性状本质。遗传密码破译是20世纪60年代分子生物学领域最重大的进展，它全面影响了生命科学，一方面拓展了对许多生命现象的理解，另一方面促进了分子生物学的应用，为基因工程诞生提供了关键性的基础。

基因合成

一旦遗传密码的密码被发现，科拉纳的研究重点就转移到基因结构与功能关联方面的研究，开始探索DNA蛋白质之间存在的相互作用。为了更好理解基因表达，科拉纳开始进行DNA的合成和测序研究。科拉纳认识到tRNA在蛋白质合成过程中的重要性，决定首先人工合成编码酵母丙氨酸转运RNA(tRNAAla)相对应的DNA。之所以选择合成tRNAAla，一方面在于序列已知(1965年由霍利确定)，另一方面tRNA对应的DNA序列较短，合成难度相对较低。1970年6月，在威斯康星大学举办的一次生物化学家研讨会上，科拉纳宣布了自己的结果，第一次实现了酵母tRNAAla基因的化学全合成[8]，该成就被看作是分子生物学研究中的一个里程碑事件。

1970年夏，科拉纳离开威斯康星大学，加入麻省理工学院(MIT)，成为生物学和生物化学Alfred P. Sloan讲座教授，在这里一直工作到2007年退休。科拉纳对这次工作单位换动的解释是：如果你想让你的智力长期保持活跃，你就应该时常改变自己的环境。在麻省理工学院，科拉纳继续进行基因合成研究。早期合成的酵母tRNAAla基因尽管可用于研究DNA 的转录和酶学，但不适合其他方面的研究，如转录起始和终止机制、RNA结构功能的关联等。为了解决该问题，科拉纳和助手又着手进行编码大肠杆菌酪氨酸阻遏 tRNA前体的 DNA合成，该DNA由126个核苷酸残基构成，在合成过程中涉及到26个寡脱氧核苷酸片段的合成、多聚核苷酸连接酶催化的几种片段连接以形成拥有合适互补单链末端的四个DNA双链、将双链连接而形成完整DNA等[9]。1976年，科拉纳宣布合成了完全具有功能的人造基因[10]，该基因拥有表达需要的所有元件，可在大肠杆菌内正常转录。这是人类第一次实现人造基因，科拉纳所发明的人工合成基因片段的方法一方面奠定了研究基因结构决定功能机理研究的基础，另一方面还成为基因工程的重要工具。今天，生物学家和生物化学家在进行位点特异性突变、基因克隆、DNA测序、聚合酶链式反应扩增和其他实验等都广泛应用到合成的DNA。

20世纪80年代，科拉纳又拓展了研究方向，重点对涉及到视觉感知的分子——视紫红质蛋白的化学和分子生物学进行研究[11]。科拉纳研究小组合成了细菌视紫红质基因，阐明了其在光信号转导过程中质子运输机制和表达调节机制。科拉纳仍然应用多学科交叉的方法，包括生物化学、遗传学、化学和细胞生物学等来阐明哺乳动物视觉感官系统和 G蛋白偶联受体的作用机制，此外还研究了生物膜和生物能学等知识。

20世纪90年代，科拉纳在视觉方面的工作促使发现了视紫红质基因突变造成的蛋白质折叠异常是引发遗传性色素视网膜炎失明的重要原因，对这些基因突变形式的研究有助于理解色素视网膜炎特定的临床症状。

重要贡献

科拉纳不但是一位伟大的科学家，而且还是一位伟大的教育家，在培养年轻科学家方面也贡献重要力量。科拉纳共指导了 150多名博士后和多名研究生，许多已成为世界重要学术机构或生物技术公司的领导者。科拉纳一生发表450多篇论文，尤其是酵母tRNAAla基因合成论文于 1972年12月份《分子生物学杂志》整版刊登(共15篇，313页)，也说明了科拉纳的研究对科学界的重要性。

1966年，科拉纳成为美国公民，他非常专注于自己的工作，很少离开工作岗位，一直不知疲倦地工作，曾经连续十二年未曾度假。尽管已取得美国国籍，但科拉纳还非常关注印度的发展，2007年，创立科拉纳奖学金计划，这是一个在印度大学学生和威斯康星大学学者之间进行交换的计划。通过该计划，许多威斯康星大学老师来到印度，而许多印度学生可进入威斯康星大学深造，对提升印度教育具有十分重要的意义。

除获得诺贝尔奖外，科拉纳还获得大量重要奖项和荣誉，如加拿大化学研究所授予的默克奖(1958年)、Dannie-Heinneman奖(1967年)、约翰霍普金斯大学授予的Remsen奖(1968年)、由于合成有机化学创造性工作而获得的美国化学学会奖(1958年)、拉斯克基础医学奖(the Lasker Foundation Award for Basic Medical Research,1968年)、Willard Gibbs奖(1974年)、美国国家科学奖章(1987)等，科拉纳是美国科学院院士(1966年)、美国艺术和科学院院士、美国科学促进会会员、苏联科学院外籍院士(1971年)和印度化学学会荣誉会员(1974年)等。科拉纳获得多所学校授予的荣誉学位，如利物浦大学、英属哥伦比亚大学、芝加哥大学和旁遮普大学等。

2011年11月9日，科拉纳在美国马萨诸塞州的康科德市(Concord) 去世，享年 89岁。去世后，科拉纳的学生和同事在多家杂志上发表讣告怀念这位科学大师[2-4,12-13]，此外多家报纸如《纽约时报》和《华盛顿邮报》等也刊登了相关文章。科拉纳是分子生物学领域的一位巨人，MIT生物系主任凯撒(Chris Kaiser)将科拉纳评价为“一位杰出且具开创精神的科学家”。

遗传密码破译和基因人工合成是20世纪生命科学中的重大突破，科拉纳对推动分子生物学及相关学科的发展发挥了至关重要的作用，因此撰写此文以示对科拉纳教授的怀念。

(2012年3月19日收稿)

[1]郭晓强.遗传密码之父——尼伦伯格[J]. 科学, 2011, 63 (3): 50-53.

[2]RAJBHANDARY U L. Har Gobind Khorana (1922—2011) [J]. Nature, 2011,480(7377): 322.

[3]SAKMAR T P. Har Gobind Khorana(1922—2011): pioneering spirit [J].PLoS Biol, 2012, 10(2): e1001273.

[4]CARUTHERS M, RETROSPECTIVE W R. Har Gobind Khorana (1922—2011)[J]. Science, 2011, 334(6062): 1511.

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[6]KHORANA H G, BÜCHI H, GHOSH H,et al. Polynucleotide synthesis and the genetic code [J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1966, 31: 39-49.

[7]SHAMPO M A, KYLE R A. Har Gobind Khorana—Nobel Prize for physiology or medicine [J]. Mayo Clin Proc, 2006,81(3): 284.

[8]AGARWAL K L, BÜCHI H, CARUTHE RS M H, et al. Total synthesis of the gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast [J]. Nature, 1970, 227(5253):27-34.

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[13]SAKMAR T P. Har Gobind Khorana(1922—2011): chemical biology pioneer[J]. ACS Chem Biol, 2012, 7(2):250-251.

Founder of gene synthesis:Har Gobind Khorana

GUO Xiao-qiang
Lecturer，Department of Biochemistry，Bethune Military Medical College，Shijiazhuang 050081，China

Khorana, genetic code,gene synthesis, Nobel prize in physiology or medicine

10.3969/j.issn.0253-9608.2013.02.010

(编辑：温文)