龙胆苦苷PLGA纳米粒的制备

刘 卢，吕邵娃，张坤驰，李永吉

(黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040)

龙胆苦苷是龙胆科龙胆属植物的有效成分，是龙胆及当药等植物中的苦味成分，属于裂环烯醚萜苷类，极性大，在有机溶剂中溶解度较小.龙胆苦苷具有保护肝脏、抗氧化、抗炎、镇痛及抗肿瘤等作用，同时，龙胆苦苷能减轻二甲苯导致的小鼠耳肿胀，缓解冰醋酸引起的小鼠扭体反应，对四氯化碳所致肝损伤整体动物有保护作用[1－3]，龙胆苦苷单体口服吸收快但不完全，半衰期短，生物利用度低[4].聚乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)是合成的可生物降解的高分子材料[5]，具有良好的生物相容性，作为药物载体，具有控制药物释放，提高药物疗效，降低药物毒性等特点[6]，被视为理想的聚合物载体材料且广泛应用于各种药物的纳米制剂.为了提高龙胆苦苷生物利用度，本文将龙胆苦苷制成PLGA纳米粒，并对其制备工艺和性质表征进行深入研究.

1 试剂与仪器

1.1 试剂

龙胆苦苷标准品(Cheng Du Must Bio－Technology Co.Ltd.批号:MUST －11011401);泊洛沙姆188(上海运宏化工制剂辅料技术有限公司);乳酸－乙醇酸共聚物(PLGA，山东省医疗器械研究所);乙酸乙酯(天津市凯通化学试剂有限公司);丙酮(天津市富宇精细化工有限公司);甲醇(天津市富宇精细化工有限公司).

1.2 仪器

美国Waters公司高效液相色谱仪(系统:2996Photodiode Array Detector);色谱柱 Diamonsil C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);DT －100 型电子分析天平(上海医用科学激光仪器厂);85－2A恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器公司);旋转蒸发器(天津玻璃仪器厂);TGL－16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);Malvern Zetasizer 3000粒度测定仪 (英国Malvern公司);透射电子显微镜(TEM，TECNAIG2，荷兰飞利浦).

2 方法与结果

2.1 龙胆苦苷标准曲线的绘制

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流动相:甲醇 －水(50∶50，V/V);检测波长:270 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:室温;进样量:10 μL.

2.1.2 标准曲线

精密称取龙胆苦苷6 mg，加甲醇15 mL，配成400 μg/mL 的溶液待用.分别取0.125、0.375、0.625、1.5、2.5、5 mL加甲醇定容到10 mL，配成质量浓度为5、15、25、60、100、200 μg/mL 系列标准溶液.按上述色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，以质量浓度(C)为横坐标进行线性回归分析，得回归方程Y=9 864C+63 358(r=0.999 3)，结果表明龙胆苦苷在5～400 μg/mL范围内呈良好的线性关系，如图1.

图1 龙胆苦苷标准曲线

2.2 龙胆苦苷PLGA纳米粒的制备

2.2.1 制备方法

采用溶剂沉淀法制备龙胆苦苷PLGA纳米粒.精密称定龙胆苦苷，将龙胆苦苷加少量水溶解并与PLGA溶于丙酮和乙酸乙酯的混合溶液中，此混合物在磁力搅拌作用下，逐步加入含泊洛沙姆的水相中，一段时间后，有机溶剂扩散进水相.将制备好的GEN－PLGA倒入旋蒸瓶中，于40℃水浴中，采用减压旋转蒸发30 min，挥去有机溶剂，即得到GEN－PLGA －NP.

2.2.2 单因素考察

1)PLGA类型的选择

用三种不同类型的PLGA按照2.2.1的制备方法，其他条件均不变的情况下制备纳米粒，得出包封率和粒径的数据，结果见表1.

表1 PLGA不同类型下包封率和粒径的测定结果(n=3)

由表1可以看出，用不同类型的PLGA制备的纳米粒子，粒径无大差别，但分子质量为50/50型号的PLGA制得的纳米粒，包封率相对较高.

2)不同有机溶剂的选择

其他条件不变的情况下，考虑有机溶剂对纳米粒包封率和粒径的影响，由文献可知[7－8]，丙酮为适合水溶性药物的有机溶剂，但单独使用包封率较低，故选用混合有机溶剂，进行研究，数据见表2.

表2 有机溶剂不同比例下的包封率和粒径的测定结果(n=3)

由表2可以看出，丙酮与乙酸乙酯为1∶1时，纳米粒的包封率最好.

3)不同质量分数下的PLGA的选择

其他条件不变的情况下，考虑不同PLGA质量分数对包封率和粒径的影响，结果见表3.

表3 PLGA不同质量分数下的包封率和粒径的测定结果(n=3)

由表3可知，PLGA质量分数为1%时，纳米粒包封率较高.

2.2.3 正交实验优化处方

影响药物包封率的因素很多，本文以2.2.1制备方法为基础，选择影响纳米粒子制备的泊洛沙姆质量分数(A)、PLGA质量分数(B)、内水相与有机相体积比(C)、投药量(D)这些影响较大的因素进行考察，每个因素分三个水平，见表4.正交试验设计分析结果见表5.对试验结果进行极差分析，结果见表6.

表4 实验因素水平表

表5 PLGA正交试验设计结果表

R表示极差，极差值越大，表示因素所起的作用越大.由表6可知，本实验中四个因素对包封率的影响结果为:D＞A＞C＞B.

表6 方差分析表

从正交实验结果可知，最佳制备方案为:A2B2C3D1，而方差分析结果选出的最佳方案是:A2B1C3D1.显然，正交实验的 9个方案中没有A2B1C3D1这一方案，其是否为最佳方案，需要通过实验来证明.用A2B2C3D1方案和A2B1C3D1方案各做1次验证性实验，包封率分别为40.02%和52.86%.说明A2B1C3D1方案为最佳方案，即泊洛沙姆质量分数为1%，PLGA质量分数为1%，有机相与水相之比为1∶8，投药量为3 mg.

2.3 龙胆苦苷PLGA纳米粒的性质表征

2.3.1 表观形态观察

取优化后处方制备的GEN－PLGA分散体系1～2滴，通过0.45 μm 的滤膜过滤，滴于铜网上，干燥后滴入2%的磷钨酸溶液，染色2～3 min，自然干燥，透射电镜观察纳米粒的形态，如图2所示.

图2 GEN－PLGA纳米粒透射电镜照片(×43000)

2.3.2 GEN－PLGA的粒径与Zeta电位测定

将正交优化后的GEN－PLGA样品，配成适当质量分数后，用激光粒径分布仪测定GEN－PLGA粒径分布.测得平均粒径为(131.3±3.2)nm，粒径分散指数PDI值为0.248 ±0.02，Zeta电位为( －21.6 ±0.31)mV，见图3、4.

2.3.3 GEN－PLGA的包封率和载药量的测定

精密吸取1 mL龙胆苦苷PLGA纳米粒混悬液定容至5 mL，在10 000 r/min离心20 min，然后取上清液过0.45 μm微孔滤膜.采用高效液相色谱法，10 μL进样记录HPLC色谱测得峰面积，计算出上清液中游离药物的质量浓度，计算包封率和载药量.包封率的计算公式如下:包封率(ER%)=(W0－W)/W0×100% 载药量(DL%)=(W0－W)/M×100%其中:W是游离药物质量，W0为总投药量，M是纳米粒的质量.通过以上公式计算出，GEN－PLGA 的载药量为(2.44±1.45)%，包封率为(52.86 ±2.86)%.

3 讨论

本实验考察了实验中各因素对纳米粒成型的影响，首先是有机相的选择，在制备过程中，药物和聚合物一起溶于有机溶剂，需要根据药物的性质选择合适的有机溶剂.其次是匀化强度，如果强度过小，有机相在水相中分散的不均匀，可由观察其外观获知.对纳米粒粒径的影响，主要依赖于制备方法和材料的选择.聚合物的黏度、有机相与水相比、表面活性剂的选择均对粒径大小有一定影响，但改变这些条件，粒径变化不大.而制备过程中的匀化强度则为决定粒径大小的因素，预实验中考察此条件时，当强度过大时，粒径小于100 nm，此时包封率极低，可能过大的强度破坏了药物和聚合物形成的体系，导致包封率降低.

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