高效液相色谱法检测鸡蛋中三聚氰胺残留量的探讨

陈 玲 魏秀丽 尹伶灵 张呈军 张 颖

（山东省兽药质量检验所 济南 250022）

近几年来发生的三聚氰胺奶粉、饲料、鸡蛋等事件的曝光，严重影响了畜产品安全[1]。三聚氰胺(化学式：C3H6N6)，俗称蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被广泛用作化工原料。但因三聚氰胺含氮量高，被不法分子添加于奶粉和饲料中增加蛋白质含量。三聚氰胺奶粉、鸡蛋事件引起了广泛的关注。随后国家及科研机构发布了原料乳、饲料中三聚氰胺的检测标准，有液相色谱法、气质、液质等方法[1-5]，但鸡蛋中三聚氰胺的检测方法极少。为了保障鸡蛋食品的安全，本实验室开发了鸡蛋中三聚氰胺残留量的检测-高效液相色谱法。试样经匀质、用三氯乙酸提取、固相萃取柱净化，通过优化色谱条件，采用反反向色谱柱，经紫外检测器检测，外标法定量,线性良好，回收率高，满足检测需求。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪：配紫外检测器。分析天平：感量0.00001g。离心机：8000r/min。组织匀浆机。振荡器。氮吹仪。

1.2 药品及试剂

三聚氰胺标准品（C3H6N6）：德国DR.公司C14861400，批号81114，含量99.00%。甲醇、乙腈：色谱纯。三氯乙酸、醋酸铅、氨水、醋酸铵、盐酸均为分析纯。超纯水。MCX弱阳离子交换萃取柱。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：XBridgeTM Hilic 5µm，4.6×150mm；流动相：10mmol醋酸铵水溶液：乙腈(v/v,5/95)溶液；紫外检测器波长：230nm，流速：1.0ml/min；柱温30℃；进样量为20μl。

1.3.2 三聚氰胺标准储备液(1.0mg/ml)及标准曲线的绘制准确称取50mg三聚氰胺标准物质(精确至0.1mg)，用甲醇溶液(50%)溶解后并定容至50ml容量瓶中，混匀，4℃条件下保存，有效期为3个月。准确取适量标准储备液用流动相稀释成0.5、1、2.5、5、10、25、50μg/ml的系列标准溶液，供高效液相色谱测定。以三聚氰胺标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 样品制备 提取：鸡蛋样品匀浆，准确称取试样适量2.00+0.05g于50ml试管中，准确加入9ml浓度为1%的三氯乙酸溶液，然后加入1ml饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白，旋涡1min，摇床震荡提取15min，8000r/min离心10min，取上清液备用。净化：分别用3ml甲醇，5ml水活化mcx固相萃取小柱，取5ml提取液过柱后，用0.1mol的盐酸和甲醇洗涤小柱，挤干后用3ml浓度为5%的氨水甲醇洗涤溶液洗脱，收集洗脱液用氮气吹干，最后用1ml流动相溶解，用0.22um的滤膜过滤后，用HPLC测定。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

在选定的色谱条件下，可以有效的分离三聚氰胺，在0.5-50μg/ml范围内，标准曲线y=3.33×104x+1.08×103(R2=0.9999)，线性良好。

2.2 方法的灵敏度

鸡蛋的空白试料按上述的步骤处理后，测定结果表明：在相应的保留时间，空白试料对所测分析物无干扰。空白图谱见图1，三聚氰胺标准图谱见图2，三聚氰胺阳性添加图谱见图3。

图1 空白鸡蛋色谱图

图2 三聚氰胺(1ug/ml)标准色谱图

图3 三聚氰胺(2.5mg/kg)阳性添加色谱图

在空白鸡蛋中添加三聚氰胺标准溶液，分别制成0.5、1、2.5、5mg/kg三个浓度的空白添加样品，按确定的提取净化方法处理后，经高效液相检测，计算信噪比。添加浓度为0.5mg/kg时，三聚氰胺峰信噪比(S/N)>3，确定为方法的检测限，添加浓度为1mg/kg时，三聚氰胺峰峰面积响应值和信噪比满足最低定量限的要求信噪比(S/N)>10，确定为方法的最低定量限。

2.3 方法的精密度和准确度

采用标准添加法，在鸡蛋空白匀浆组织中添加3个不同浓度的三聚氰胺进行回收率试验。三聚氰胺分离良好，无任何干扰物，阳性添加回收率均在70%～100%范围内。鸡蛋中的添加浓度分别为0.5mg/kg(检测限)、1mg/kg(定量限)、2.5mg/kg(MRL)、5mg/kg(2MRL)。各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，批内、批间相对标准偏差均小于10%，具体结果见表1。

表1 鸡蛋中三聚氰胺的添加回收实验结果 (%)

2.4 反反相色谱柱、色谱柱寿命长、色谱峰峰形

GB/T22388-2008原料乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法-HPLC中检测三聚氰胺[2]采用的是反相色谱柱，流动相采用的是离子对试剂缓冲溶液乙腈。由于流动相中含有大量的离子对柠檬酸和辛烷磺酸钠，平衡色谱柱和冲洗色谱柱需要时间长，而且容易对色谱柱造成损害，色谱柱寿命较短，经济成本较高。本研究采用反反相色谱柱XBridgeTMhilic色谱柱，与传统色谱柱相比其稳定性和重现性更好，没有采取离子对的流动相，保护色谱柱，使三聚氰胺的分离具有完美的色谱峰形和最高柱效。

3 结论

本方法采用1%三氯乙酸溶液提取、固相萃取柱净化，高效液相色谱法测定，成功建立了鸡蛋中三聚氰胺的残留检测方法。此方法对样品提取、净化过程和仪器条件进行了优化改进，三聚氰胺的检测限为0.5mg/kg，最低定量限为1mg/kg。整个实验过程简单、快速，回收率较高，适合样品鸡蛋中三聚氰胺残留的定量检测。

[1].李红梅, 张庆合, 汤桦等.GB/T 22400-2008 原料乳中三聚氰胺快速液相色谱法[S].北京: 中国标准出版社, 2008.

[2].宋书锋, 鲁杰, 安娟等.GB/T 22388-2008.原料乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法[S].北京: 中国标准出版社, 2008.

[3].蔡勤仁, 欧阳颖瑜, 钱振杰等.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺[J].色谱, 2008, 26(3).

[4].冯家望, 蔡勤仁, 柳训才等.高效液相色谱-电喷雾串联技术测定奶及奶制品中三聚氰胺和环丙氨嗪[J].现代食品科技, 2008, 24(10).

[5]魏瑞成, 黄思瑜, 侯翔等.鸡蛋中的三聚氰胺残留的检测[J].江苏农业学报, 2008, 24(6).

[6]汪辉, 彭新凯, 李文丽等.高效液相色谱测定生鲜乳及乳制品中的三聚氰胺的方法研究[J].食品科学, 2008, 29(10).

[7]李志伟, 霍云霞, 刘佳等.高效毛细管电泳法测定奶制品中的三聚氰胺含量[J].食品科学, 2010, 31(2).

[8]吴彩梅, 白洁, 贾刚等.高效液相色谱法测定鸡蛋中的三聚氰胺[J].食品科学, 2011, 32(8).