辽宁新病害核桃枝枯病病原鉴定

孙俊

摘 要： 【目的】为了对辽宁省近年发生的新病害—核桃枝枯病的病原进行鉴定，【方法】采集辽宁省葫芦岛市建昌县核桃枝枯病样品，通过对病原菌形态观察、致病性测定，以及rDNA-ITS序列分析。【结果】经分离纯化获得病原菌，通过柯赫氏法则证病，接种后出现的病害症状与直接采集到的病害标样症状一致，确定其为致病菌；对病原菌进行传统的形态学观察，病原菌分生孢子器和分生孢子的形态与胡桃楸拟茎点霉较相似；将待测菌株rDNA-ITS序列与GenBank中相关菌株的ITS序列进行同源性比较，与Phomopsis sp. （GenBank 收录号： HM595508.1）的同源性达到99%。【结论】确定辽宁地区新病害核桃枝枯病的病原菌为胡桃楸拟茎点霉Phomopsis juglandina。

关键词： 核桃； 枝枯病； 拟茎点霉

中图分类号：S664.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0669-03

胡桃（Juglans regial L.） 原产中亚，又叫核桃、羌桃、合桃等，是胡桃科核桃属多年生落叶乔木。我国的核桃栽培历史悠久，种质资源丰富。核桃仁中含有丰富的脂肪、蛋白质、碳水化合物及微量元素，它还含有对人体有特殊功效的营养物质，具有很高的营养价值。医学认为核桃性温、味甘、无毒，有健胃、补血、润肺、养神等功效[1]。20世纪90年代以来，美国等国科学家通过营养学和病理学研究认为，核桃对于心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、癌症和神经系统疾病有一定的康复治疗和预防效果。

而随着核桃的营养价值和药用价值逐渐被人们重视，核桃的种植面积越来越大，随之而来的是病害的发生越来越严重。近年来，在大面积种植核桃中，核桃枯枝病各地均有发生。主要危害枝条和树干，尤其是1～2 a生枝条易受害，一般发病株率20%～30%，严重的发病株率超过80%，如遇湿度太大时，引起枝条大量死亡，直接影响到树体生长，进而影响核桃产量。目前国内外对于核桃枝枯病的研究多针对矩圆黑盘孢菌Melanconium oblongum所致的枝枯病[1-2]，而对于拟茎点霉Phomopsis juglandina引起的核桃枝枯病在我国仅在云南昆明曾见有报道[3-4]。在乌克兰曾有过拟茎点霉引起核桃枝枯病的报道[5-6]。

作者针对辽宁省核桃枝枯病进行了病原菌分离鉴定，柯赫氏法则证病，病原菌rDNA-ITS分析，以便为搞清病害的发病规律、核桃的科学栽培管理及其防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

核桃枝枯病标样于2012年5月在辽宁省葫芦岛市建昌县养马甸子乡平房子村采集。根据核桃枯枝危害的症状特点进行描述记载。

1.2 病原菌鉴定

1.2.1 病菌形态特征观察 采用常规分离方法进行病原菌分离并纯化[7]。病菌在PDA平板上25 ℃培养，观察并计测菌落、分生孢子器和分生孢子形态。

1.2.2 柯赫氏法则证病 选取长势一致的1 a生核桃植株，采用3种接种方法。（1）菌饼覆盖针刺法： 在核桃枝条上用消毒的针头刺10针，用打孔器无菌打取7 mm菌饼，将菌丝面朝向核桃枝条针刺部覆盖。（2）孢悬液注射法： 用注射器吸取0.5 mL孢悬液（107个·mL-1）注射寄主枝条表皮中。（3）嫩枝离体接种法： 选取同一部位的嫩枝，用打孔器无菌打取7 mm菌饼，将菌丝面朝向核桃接种嫩枝切面覆盖。接种后室温保湿培养24～48 h。每种方法重复3次。跟踪观察致病结果。

2 结果与分析

2.1 病害症状与病原菌形态观察

2.2 柯赫氏法则证病结果

2.3 病菌ITS序列测定结果

3 讨 论

国内关于拟茎点霉引起的核桃枝枯病只在云南昆明有过发现[3]，至今再无报道，笔者首次在辽宁地区发现此病害，并通过传统形态学鉴定及对核桃枝枯病菌进行rDNA-ITS序列分析相结合的方法，运用分子和生物学双重手段对辽宁地区核桃枝枯病菌进行鉴定，鉴定方法方便、快速、准确。

在试验中多次重复回接过程中发现，拟茎点霉对核桃嫩枝的侵染力较强，3种接种方式，病菌均可侵染。由此分析认为病原菌极易通过伤口侵染核桃新梢，而且在温暖多雨多雾的环境中病菌更易侵染和传播。从试验结果来看，主枝接种发病的症状与成株期核桃树枝条自然条件下的发病症状相似；而嫩枝接种后发病症状与成株期核桃树枝条自然条件下发病症状有所差别，这可能与枝条的木质化程度、皮层厚度、及生长势之间的差异有关。

本文针对辽宁省新见病害—核桃枝枯病病菌的研究，在病菌生物学特性研究方面尚需全面深入，病菌寄主范围尚待测定，病菌侵染特性及其机制有待于深入研究，以便为生产上病害防治提供系统的理论依据。（本文图版见插7）

参考文献 References：

[1] HU Guo-liang， LI Wen-biao， MA Liang-jin. Walnut twig blight observation and research[J]. Zhejiang Forestry Science and Technology， 1992， 12（1）： 18-22.

胡国良，李文彪，马良进. 山核桃枝枯病观察与研究[J]. 浙江林业科技，1992，12（1）： 18-22.

[2] LI Hui-qin. Walnut twig blight prevention technology[J]. Modern Rural Science and Technology， 2012， 18： 29.

李会钦. 核桃枝枯病防治技术[J]. 现代农村科技，2012，18： 29.

[3] QI Pei-kun， JIANG Zi-de， XIANG Mei-mei. Chinese Journal of fungi， Phomopsis sp[M]. Beijing： Science Press，2007.

戚佩坤，姜子德，向梅梅. 中国真菌志（34），拟茎点霉属[M]. 北京： 科学出版社，2007.

[4] UECKER F A. A world list of Phomopsis names with notes on nomenclature， morphology and biology[M]. Mycol Memoir，1988.

[5] ISIKOV V P. Plant pathogenic fungi causing some diseases on trees in the Crimean steppe[J]. Mycology & Phytopathology， 1978， 12 （3）： 251-254.

[6] HELUTA V P，MEREZHKO T O，SMIK L V. Microfungi of Askania arboretum[J]. Ukrainian Botanical Journal，1992， 49 （6）： 50-54.

[7] FANG Zhong-da. Plant pathology research methods[M]. Beijing： China Agriculture Press，1998.

方中达. 植病研究方法[M]. 北京： 中国农业出版社，1998.