苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感基线及其室内抗药突变体研究

范昆　曲健禄等

摘 要： 【目的】为明确苹果主产区轮纹病菌对戊唑醇的敏感现状，并评价苹果轮纹病菌对戊唑醇的抗性风险，【方法】采用菌丝生长速率法，测定了51株采自山东、河北、陕西等地的苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性，并通过紫外线诱变野生敏感菌株获得抗药性突变体，进一步利用菌丝生长速率法测定抗性菌株对其他一些杀菌剂的交互抗性并比较其与敏感菌株之间的部分生物学特性。【结果】51株苹果轮纹病菌菌株EC50值分布于0.0111～ 0.7264 mg·L-1，平均EC50值（0.2541±0.0151） mg·L-1，其对戊唑醇的敏感性呈单峰分布，可作为将来进行田间苹果轮纹病菌对戊唑醇抗药性检测的敏感性基线。通过紫外线诱变野生敏感菌株获得9株抗性突变体，抗性倍数在11.00～67.88。抗性菌株UV- TS1-10对丙环唑等7种药剂表现出了不同程度的交互抗药性。9株抗戊唑醇突变体继代培养至第9代，抗性倍数逐渐下降，表明所获抗性不能稳定遗传。抗药性突变体的菌丝生长速率与亲本菌株无明显差异，而菌丝干重却与亲本菌株相比显著性降低。【结论】苹果轮纹病菌对戊唑醇具有中度至高度抗药性风险，生产中需引起高度重视。

关键词： 苹果轮纹病菌； 戊唑醇； 敏感基线； 抗药突变体

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0650-07

苹果轮纹病（Apple ring rot）在中国最早于1928年发现于辽宁，随着易感轮纹病品种富士在中国的大面积推广，该病已成为近年来苹果生产上危害最为严重的一种病害[1]，可同时危害苹果树的枝干和果实，且贮藏期可持续发病[2-3]，给果农带来严重的经济损失。当前化学杀菌剂仍是防治苹果轮纹病的主要手段，其中，戊唑醇是近年筛选出防治苹果轮纹病的重要化学农药品种，该药剂是德国拜耳公司于20世纪80年代开发的三唑类杀菌剂，90年代中期开始在中国苹果树上登记使用[4]。戊唑醇通过阻碍真菌麦角甾醇的生物合成而影响真菌细胞膜的形成，具有内吸、广谱特点[5]，对苹果轮纹病具有良好的防治效果[1]，近年来该药剂已成为防治苹果轮纹病的主要杀菌剂。Leroux等[6]田间监测到了葡萄灰霉病菌（Botryotinia fuckeliana）对戊唑醇的抗性菌株，Robbertse等[7]研究发现大麦上连续3年使用戊唑醇，大麦云纹病菌（Rhynchosporium secalis）对其敏感性显著降低，Ma等[8]在连续4 a使用戊唑醇的开心果果园发现开心果枝枯病菌（Botryosphaeria dothidea）对戊唑醇的EC50值显著高于由野生敏感菌株建立的敏感基线。目前，尚未见到关于苹果轮纹病菌对戊唑醇抗药性的系统报道，而抗性菌株生物学特性研究对预测抗性的发生发展，以及制定科学的病害防治策略具有重要意义。作者通过检测苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性，建立了敏感基线，并通过紫外诱导获得了抗性菌株，测定了敏感菌株与抗性菌株之间的生物学特性差异，明确该菌对戊唑醇的抗性风险，为戊唑醇的合理使用，避免或减缓该菌对戊唑醇抗性的产生提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 苹果轮纹病果于2007年8—10月从山东（栖霞、沂源、蒙阴、泰山）、河北（衡水）、陕西（大荔、合阳、澄城）等地的不同行政区域且相距一定距离的未施用过戊唑醇及其他三唑类药剂的果园内采集，装入干净的小塑料袋中（每个袋子只装一个标本），带回实验室分离纯化，鉴定后获得51株苹果轮纹病菌株（Botryosphaeria dothidea）。

1.1.2 供试药剂 98% 戊唑醇（Tebuconazole）原药，江苏常隆化工有限公司；98.8%嘧菌酯（Azoxystrobin）原药，上虞颖泰精细化工有限公司；95%醚菌酯（kresoxim-methyl）原药，山东亿嘉农化有限公司；96%异菌脲（Iprodione）原药，江西禾益化工有限公司；97%多菌灵（Carbendazim）原药，青岛瀚生公司；96.4%丙环唑（Propiconazole）原药，江苏扬农化工集团；95.8%苯醚甲环唑（Difenoconazole）原药，青岛瀚生公司；92%氟硅唑（Flusilazole）原药，青岛瀚生公司。将多菌灵原药溶于1 mol·L-1 HCL溶液，其余原药溶于丙酮，制成104 mg·L-1的母液，置4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性测定

1.4 抗性菌系遗传稳定性测定

将抗药突变体菌株在无药PDA平板上连续继代培养9代，按1.2中的菌丝生长速率法测定连续继代后第1，3，5，7，9代抗性菌株对戊唑醇的敏感性（EC50值），计算抗性倍数。根据抗性倍数的变化情况确定病原菌抗药性状的遗传稳定性（抗性倍数变化较小或基本保持不变则能稳定遗传，否则可能不能稳定遗传）。

1.5 交互抗性测定

在离体条件下，分别测定戊唑醇抗药突变体及亲本菌株对苯醚甲环唑、丙环唑、多菌灵、异菌脲和代森锰锌的敏感性，分析其有无交互抗药性。

1.6 抗药突变体生长量测定

2 结果与分析

2.1 苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性基线建立

2.2 抗药性突变体及抗药性水平

2.3 抗性菌株UV- TS1-10交互抗药性测定

采用敏感菌株TS1及其抗戊唑醇突变体UV- TS1-10测定了其对丙环唑、苯醚甲环唑、氟硅唑、多菌灵、异菌脲、嘧菌酯、醚菌酯的敏感性（表3），结果表明，抗戊唑醇菌株UV- TS1-10对丙环唑、苯醚甲环唑、氟硅唑3种同属三唑类的药剂均产生了不同水平的交互抗性，与敏感菌株相比，其交互抗性倍数分别达3.10倍、20.62倍、1.62倍，由此表明，戊唑醇对苯醚甲环唑可能易产生交互抗性。抗戊唑醇菌株对二甲酰亚胺类药剂异菌脲虽产生了一定水平的抗性，但抗性水平并不高，为1.01倍，说明抗戊唑醇菌株随着抗性水平的提高可能也会对二甲酰亚胺类药剂产生较高水平的交互抗性。抗戊唑醇菌株与苯并咪唑类杀菌剂多菌灵、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯、醚菌酯存在负交互抗性现象，因此推测将戊唑醇与这3种杀菌剂混合或交替使用，将有可能延缓其抗药性的发生。

2.4 抗药性遗传稳定性测定

2.5 抗性突变体菌丝生长量测定

3 讨 论

戊唑醇是1，2，4-三唑衍生物，高效、广谱、内吸、低毒的三唑类杀菌剂[18]，由于其独特的作用机制，使得其对危害作物生长的多数真菌病害均有良好的防治效果，因而被广泛使用[5]，现已成为防治果树、小麦、玉米、蔬菜等作物病害的主要药剂之一[19-20]。戊唑醇于20世纪90年代中期开始在中国苹果树上登记使用，研究靶标生物的敏感性基线和评估抗药性风险，对科学制定该杀菌剂的使用策略和为监测靶标生物群体的敏感性变化提供理论依据具有重要的应用价值[15]。

本研究测定的采自山东、河北、陕西等省份的51个苹果轮纹病菌菌株对戊唑醇的EC50平均值为（0.254 1±0.015 1） mg·L-1。从频率分布看，对戊唑醇不同敏感性菌株的频率呈连续的单峰曲线分布。因此，该平均值基本可以作为苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性基线。另外，供试菌株对戊唑醇的敏感性存在较大差异，EC50值高值约为最低值的65.4倍，分析原因可能与苹果轮纹病菌的种群结构[21-22]和病菌本身生理差异有关，此问题还有待进一步研究。

真菌对甾醇脱甲基类抑制剂（DMIs）的抗性是由多基因控制的，而且其抗药突变体的适应性差，在自然界中很难形成抗性群体，由此认为病菌对这类杀菌剂产生抗药性的风险很低[23-24]。然而由于该类杀菌剂大量、连续使用，目前，已有田间采集菌株对戊唑醇产生抗性的报道，林才华等[25]从山东省草莓主产区采集分离的草莓枯萎病菌株中发现了对戊唑醇达10.54倍的抗性菌株；王英姿等[4]测定了山东省苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性，发现15.49%的菌株对戊唑醇已产生2～5倍的低水平抗药性。对于病原菌对戊唑醇的抗性风险评估的研究，已有很多报道，刘英华等[18]利用戊唑醇对禾谷丝核菌进行多代汰选，获得了抗性倍数达到33.4倍的抗性菌株，抗戊唑醇禾谷丝核菌对三唑酮、丙环唑、井冈霉素、福美双和噁醚唑均具有显著的交互抗性。Akallal 等[26]经过室内诱导获得了对戊唑醇具有抗性的血红丛赤壳菌Nectria haematococca，抗性菌株对其他三唑类杀菌剂均表现出明显的交互抗性。叶滔等[14]通过紫外线诱导，获得了8株对戊唑醇具有不同抗性水平的禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）抗药突变体，其抗性倍数最高达到186.03倍。本试验结果表明，采自不同行政区域的苹果轮纹病菌菌株在室内紫外光诱变条件下，共获得9株不同抗性水平的突变体，其中2株抗性倍数高达67.88倍、65.72倍的高抗突变体，各菌株对戊唑醇产生抗药性突变的频率和抗性发展速度不一致，这种差异可能与病菌本身生理差异和来源地用药历史不同等因素造成的。实验表明，抗药性突变体之间的菌丝生长速率与亲本菌株虽无明显差异，而菌丝干质量却与亲本菌株相比显著性降低，该特性可能不利于抗药性群体的形成，同时，在脱离药剂的情况下，继代培养至第9代后，其EC50值均呈逐渐下降趋势，表明所获抗性可能不能稳定遗传，而其中UV- TS1-f、UV- TS1-10 抗性菌株的EC50值降幅相对缓慢，在转接至第9代时抗药性倍数仍很高，仍表现高水平抗性。

综上所述，作者认为，苹果轮纹病菌对戊唑醇的室内抗药性具有高度至中等风险。这不仅为抗性治理带来了困难，也证明苹果轮纹病菌对戊唑醇抗性风险较大，再生产上应引起重视，加强抗性检测。本研究发现，苹果轮纹病菌不仅对三唑类药剂产生了不同水平的交互抗性，对二甲酰亚胺类药剂异菌脲也产生了微弱的交互抗性现象，而与苯并咪唑类杀菌剂多菌灵、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯、醚菌酯存在负交互抗性现象。李晓军等[28]发现，不同地理来源的苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性都处在较高水平，总体上不存在明显差异，没有出现敏感性下降的抗药性亚群体。另据李晓军等[27]报道，苹果轮纹病菌对异菌脲仍处于相对敏感水平。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯、醚菌酯作为防治苹果病害的新药剂代表，应用于防治苹果轮纹病才刚刚起步，应是与戊唑醇轮换使用防治苹果轮纹病的有效药剂。因此在推广戊唑醇防治苹果轮纹病时，建议加强对苹果轮纹病菌的抗性监测，降低使用次数及用量，提倡戊唑醇或其他三唑类药剂与不同作用方式的药剂轮换使用，避免三唑类药剂间的轮换使用，以避免或延缓抗药性的产生，延长该药剂的使用寿命。

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