脂肪酶的酯合成活性检测方法及其应用研究进展

徐晓勇，鄢洪德，孟庆梅，张 群

（1.浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014；2.杭州生物医药科技创业园有限公司，浙江 杭州 310053）

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3），全称为甘油三酰酯水解酶，它可以催化水解甘油酯产生甘油、甘油单双酯和脂肪酸。目前已经被广泛应用于食品、皮革、化妆品、生物柴油、医疗医药和洗涤剂等多个工业生产领域。随着技术的发展与革新，脂肪酶在非水相中的应用越来越广泛，也受到越来越多研究者的重视。目前脂肪酶主要在非水相中进行酯合成、酯化拆分和转酯化拆分等反应。此时，利用传统方法筛选到的脂肪酶可能并不适用于非水相中的催化反应。因为传统的筛选方法，是检测脂肪酶在水相中的水解活力，在实际应用中由于反应体系的改变，脂肪酶可能表现出较低的酶活力，这与筛选过程中的酶活力不一致。究其原因，是由于在非水相中，酶的构象发生改变，从而导致酶的催化性能也发生变化。

为克服由于反应体系的变化导致的酶活力不一致的问题，一些研究者试图建立一种快速、方便的方法来筛选具有酯合成活力的脂肪酶，并进行合成活力的测定。由于脂肪酶催化底物的多样性，因此研究者需要根据脂肪酶在非水相中不同的应用范围，探索不同的酯合成活力脂肪酶的筛选和检测方法。笔者基于脂肪酶的酯合成活性检测方法的重要性这个事实，对非水相中脂肪酶的酯合成活性检测方法进行了总结，并对目前脂肪酶在非水相体系中的应用情况也进行了简要介绍。

1 脂肪酶的酯合成活性检测方法

目前用于酯合成的检测方法主要有：（1）滴定法；（2）平板检测法；（3）吸光度检测法；（4）气相色谱检测法；（5）微量滴定板法。

1.1 滴定法

目前在产脂肪酶菌株的筛选过程中，在对脂肪酶的酯合成能力进行测定时，滴定法是经常被用到的。滴定法的原理是：在非水相介质中，脂肪酶催化酸和醇合成酯，然后通过对反应体系中剩余的酸含量进行滴定，测定脂肪酶的酯合成活性。酯合成活力主要以反应体系中的酸的减少量来定义。滴定法中涉及到一个指示剂的选择问题，下面将从指示剂角度具体来讲滴定法。

1.1.1 酚酞指示剂

酚酞又称菲诺夫他林，是一种弱的有机酸，其变色范围为 pH=8.2（无色）～9.8（红色），一般认为酚酞在稀酸或中性溶液里为无色的内酯式结构，当pH＞8.2时为红色的醌式结构[1]。因此常被用于酸碱滴定中作为碱的专用指示剂。

而罗星[2]研究脂肪酶在非水相中合成硬脂酸月桂醇酯时，在正己烷、正辛醇以及正辛酸的非水相介质中，加入脂肪酶并在40℃的水浴中进行酯和成反应一段时间，以不加酶作为空白对照。反应后以酚酞作为指示剂，用0.025 mol/L的NaOH进行滴定，记录空白和样品消耗碱的量，并将一个酯合成活力单位定义为每分钟脂肪酸减少的摩尔数与加酶量的比值。而颜兴和[3]等人在对华根霉脂肪酶进行有机合成的研究时，对合成酶活力的定义是每分钟消耗1 μmol己酸的酶量定义为一个合成酶活单位，这与罗星的通过比值定义合成酶活是不同的。徐岩[4]、Kiran[5]等人在酯合成活力定义时是在反应后的体系中，以酚酞作为指示剂，用氢氧化钠滴定反应体系中剩余的酸来计算脂肪酶的酯合成酶活。

1.1.2 百里酚蓝指示剂

百里酚蓝是一种棕绿色结晶性粉末，有异臭，溶于乙醇呈黄色，溶于稀碱液呈蓝色，不溶于水。作为酸碱指示剂的时候，其变色范围为pH1.2(红)～2.8(黄)，8.0(黄)～9.6(蓝)。而用百里酚蓝做指示剂，因为滴定终点的颜色更容易判定，减少了滴定中的误差范围。

Yun Teng[6]等人以脂肪酶催化棕榈酸和乙醇合成棕榈酸乙酯的反应中，则以含有甲醇的百里酚蓝为指示剂，用氢氧化钾-甲醇溶液进行滴定，并以每分钟消耗1μmol棕榈酸所需的酶量定义为一个酶活力单位。在该方法中，利用含有甲醇的百里酚蓝做指示剂，可以防止在滴定过程中浑浊现象的发生，是滴定体系保持一个均一的单相体系[7]。

滴定法中涉及到的两种指示剂，都具有一定的适用性，但是相比较而言，用百里酚蓝做指示剂具有准确性更高、认为产生的误差更小的优点。利用滴定法测定酯合成活力的方法，具有简单、方便、易于在实验室条件下操作。但它也存在一定的缺陷性，因为利用滴定法进行操作，是通过酸的减少量或者剩余量来定义酶活的，因此对滴定过程中的操作规范性要求比较高，而且还是存在一些人为的误差是无法避免的。

1.2 吸光度法

吸光度法的原理是利用底物与酶作用后，生成的产物具有一定的特色基团，表现出某种特定的肉眼可以观察到的颜色[8]，颜色的深浅在一定范围内与产物的浓度有关。通过标准曲线可以得到某种吸光值下的产物的量。

腾云[9]在对硝基苯棕榈酸酯（pNPP）的正庚烷溶液中，加入酶和无水乙醇进行反应，反应结束用氢氧化钠萃取对硝基苯酚（pNP），并在410 nm下测吸光度。然后根据pNP的标准曲线，计算出生成的pNP的量，将每分钟生成1 μmol pNP的量定义为一个酯合成酶活力单位。其测定原理是在有机相中脂肪酶催化pNPP和与乙醇之间的转酯化反应，通过测定吸光度以确定对硝基苯酚的生成量，从而测定合成酶活。但是这种方法在反应体系中的产物进行萃取，因此加大了操作的工作量，降低了检测效率。

而Amaya[10]等人用脂肪酶在正己烷体系中，催化辛醇和亚油酸的酯合成反应，反应后加入硅胶吸附反应体系中剩余的亚油酸后，在235 nm下测定吸光度测定脂肪酶的合成活性。该方法相对于腾云的方法，减少了萃取这一步骤，并且通过硅胶吸附掉体系中剩余的亚油酸，耗时更短，也更快捷方便。但是该方法利用的硅胶吸附剩余的酸的方法不具有普遍适用性，因此使用受到一定的限制。

1.3 气相色谱检测法

气相色谱法作为近几年用的比较多的一种检测手段，只需少量的样品就可以检测到，而且灵敏度高，应用范围也较广。在脂肪酶的酯合成活力的检测中，是利用醇和酸，在酶的催化下合成酯。然后通过气相色谱，检测生成的酯的含量来定义酶活的。

孙舒杨[11]以辛酸和乙醇为反应底物，在脂肪酶的催化下，40℃，150 r/min反应30分钟。然后离心取上清，加入2-己醇作为内标，混匀后进行气相色谱检测反应后反应液中的辛酸乙酯的含量。通过该方法可以定量的检测得到合成的酯，对结果的指示更为准确。Gandolfi[12]在5 mL的反应体系中，乙醇和酸按照 1∶1 的比例加入（1 g/L）,然后加入冻干的菌体（20 g/L）,在振荡水浴中反应。反应结束通过气相色谱进行检测酯的合成含量。Kristensen[13]等人以丙醇和月桂酸为底物，在酶催化下进行酯合成，并通过气相检测月桂酸和丙酯的含量。由于气相色谱法灵敏度高，因此在酯合成活性的检测中应用得较多。但用该方法，样品在进样之前需要经过萃取、旋蒸等一些步骤。而这需要借助一些有机试剂，增加了检测成本。

1.4 平板检测法

在进行大量筛选具有酯合成活性的脂肪酶的时候，为了减少工作量，提高筛选的效率，一些研究者利用了平板快速检测法。该方法是通过酶在含有底物的显色平板上进行反应，变色圈来表征酯合成活性的大小。

Sondoval[14]等人将菌株在含有酯合成底物（乙醇和不同的酸）的罗丹明显色平板上进行培养，具有酯合成活性的菌株由于合成了酯，因此在紫外下其酯合成位置的荧光会消失，从而在罗丹明的显色平板可以看到一个黑暗的光圈。通过这种方法，直观地显示了脂肪酶的酯合成活性的有无，以及合成活性的大小。通常在初次运用该方法的时候，需要切胶，溶解并通过高效液相色谱（HPLC）检测合成的是否是酯。

1.5 微量滴定板法

前面综述的几种方法在目前的酯合成菌株的筛选及应用过程中，使用的比较多。目前还有一种利用在滴定板上操作，通过检测具有荧光强度的产物来测定的。

Konarzycka-Bessler[15]等人利用一种微量滴定板法，该方法的基本原理如下：利用脂肪酶在有机溶剂中，作用于月桂酸乙烯酯和乙醇之间的反应。在该反应中，酮烯醇互变异构化释放出的醛与肼生成具有强荧光的肼衍生物，并通过荧光强度表征生成的酯含量。

在该方法中，只需要0.01～0.02 mg左右的酶，以及分别15 μmol的月桂酸乙烯酯和丙醇即可进行检测。但是也有一定的缺陷性，该方法需要专业性的荧光检测仪器以及相关的试剂，因此比较昂贵，难以普及。

2 脂肪酶的应用研究进展

由于人们对医药、环境、食品等方面的关注和安全意识的增强，利用生物手段以获得人们需要的产品受到越来越多人的青睐。因为生物酶法催化是一种绿色环保的合成工艺，具有专一性强、速率快，条件温和，对环境污染少等特点。而脂肪酶由于特殊的油-水界面催化特性，较高的有机溶剂耐受性，在医药，食品、环境等相关领域受到越来越多的重视。

2.1 在食品添加剂中的应用

目前在食品行业用维生素类作为抗氧化剂，但是由于其性质不稳定，常用维生素酯进行替代。而在维生素酯中尤其以合成L-抗坏血酸酯为主，因为其具有无毒、易于被消化吸收的特点。姜新慧[16]等人以L-抗坏血酸和棕榈酸为底物，用洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶在叔丁醇中催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯。经过条温度、加酶量、时间等参数的优化，最终的产率达到89.5%。李红[17]等人则以NOVOZYME435、LIPOLASE和TLIM三种脂肪酶做催化剂进行比较，在叔戊醇中合成L-抗坏血酸棕榈酸酯，结果发现当以NOVOZYME435脂肪酶作为催化剂，3 mL反应体系中酶用量为0.05 g，加入0.3 g的四丁基溴化铵作为相转移剂时，得到的产物浓度为16.6 mg/mL。

乙酸正己酯因为其独特的水果香，被当作食用香精用于食品行业中。杨本宏[18]等人以徳氏根霉菌脂肪酶为催化剂，在三氯乙烷、环己烷、正己烷、正庚烷、异辛烷五种不同的有机溶剂中，催化底物乙酸和正己醇合成乙酸正己酯，发现当以疏水性大的正庚烷为溶剂时，70℃反应5 h后，转化率达88%。

2.2 在医药化工中的应用

糖脂作为一种表面活性剂，已经被用于医药、化工等多种行业。Ferrer[19]等人以Thermomyces lanuginosus和Candida antarctica B脂肪酶为催化剂，在二甲基-二丁醇中利用脂肪酸乙烯酯的糖酯化合成糖脂，发现产物6-O-葡萄糖月桂酸酯在6 h之后转化率达到98%，产率可以达到90%以上。

布洛芬是一种治疗效果很好的抗炎药，作用机理是抑制前列腺素的合成从而达到治疗的效果。但是其S型对映体的疗效是R型的160倍，因此往往只需少量纯的S型布洛芬对映体就可以达到预期的理想治疗效果[20]。Marszall[21]等人把商业脂肪酶CRL和OF固定到处理过的磁性颗粒载体上，在环己烷中加入外消旋的布洛芬，以丙醇作为酰基受体进行拆分。其中OF脂肪酶表现出很好的拆分效果，其中动力学拆分（R，S）—布洛芬的对映体选择性（E）为19，产物的对映体过量值（e.e.p）为 83%，转化率为 42%。

1-苯乙醇的手性中间体可用于合成手性药物，而(S)-1-苯乙醇是一种重要的农药中间体。范卫东[20]以 rac-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯为底物，用Candida lipolytica脂肪酶进行转酯化拆分得到(S)-1-苯乙醇，并对拆分条件进行优化，转化率和e.e.p分别由原先的15.97%和19.00%上升到49.88%和99.53%。

单一的手性2-辛醇是合成生物杀虫剂的一种重要中间体。戴大章[21]用Ultrastable-Y分子筛固定扩展青霉脂肪酶，在50℃下对外消旋的2-辛醇进行手性拆分，反应24 h之后，转化率达到97.68%，对映体过量值（e.e）为 98.75%，对映体选择性平均达到460以上。

2.3 在环保材料中的应用

由于现在对环境保护意识加强，研究者们也在寻找一种绿色的工业产品以满足市场的需求。利用脂肪酶合成具有可降解特性的产品以替代目前一些不可被降解的，对环境危害大的产品。目前研究的较多的是利用脂肪酶催化合成具有降解特性的高分子聚酯材料。

杨金明[22]利用脂肪酶N435作为催化剂合成直链聚酯，研究结果发现当用长链的二酯和醇进行反应时，容易聚合形成直链的聚酯。而在反应体系中加入甘油进行共聚反应，可获

得更大分子量的聚酯。Numata[23]以2,2-双(羟甲基)-1,3-丙二醇和环己六醇作为聚酯合成的引发剂，最终合成了具有分支结构的聚乳酯，该结构的聚酯具有更强的降解能力，因此存在比较大的应用潜力。

3 结语与展望

在具有酯合成活性的脂肪酶筛选过程中，寻找一种合适快速的酯合成活力的检测方法不仅可以提高效率，而且也更具有针对性。目前的一些酯合成活力检测方法通常利用特定的底物快速检测，或者利用特定的酸和醇在一定条件下合成酯，通过高效气相或液相检测底物酸的减少量 （或酯的生成量）来定义合成酶活。但是目前常用的检测方法（滴定法、高效液相色谱、高效气相色谱）都存在着一定的缺陷性。而且由于脂肪酶催化合成的底物多样性和不同的实验目，导致酯合成活力的检测方法也是多样的，没有一种方法可以适用于所有的合成活力的检测，往往需要根据自己的实验目的选择合适的底物。但是随着科技的进步、实验仪器的更新以及新方法的建立，将会有一些效率更高、更经济简便的方法替代现有的检测手段应用到具有酯合成活力的脂肪酶筛选中来。

在现有的工业化应用中，作为21世纪具有竞争力的生物行业，其绿色环保的特点得到更多的国家政策的支持和企业的青睐。而生物酶作为一种绿色催化剂，不仅对环境污染，而且催化效率高，在一些生产中已经逐渐取代了传统的化学法。脂肪酶目前已经被用于一些手性药物中间体的拆分和合成相关具有应用价值的酯，并通过相关反应条件（有机溶剂种类、反应时间、加酶量、底物的摩尔比）的优化，达到我们预期的转化率和产率。但是目前还存在着一定的缺陷性，许多的研究都只是出于实验室研究阶段，离工业化应用还有很长一段的距离。未来的研究方向是通过反应器的设计优化和技术手段的改进，提高酶的纯度、固定化手段以及反应规模的扩大。

[1]王万林,史建公,刘鑫.酚酞指示剂在酸溶液中的颜色变化及其变色机理[J].化学世界,2010(3):189-191；139.

[2]罗星.非水相固定化脂肪酶合成硬脂酸月桂醇酯研究 [D].济南：山东大学,2010.

[3]颜兴和,王栋,徐岩.华根霉脂肪酶有机相合成酶活的研究[J].工业微生物,2005（2）:24-28.

[4]徐岩,王亚非,章克昌.有机相中微生物脂肪酶合成短链脂肪酸酯的研究[J].无锡轻工大学学报,1998（1）:26-30.

[5]Kiran K R.An esterification method for determination of lipase activity[J].Biotechnology Letters,2000，22(19):1511-1514.

[6]Teng,Y，.Xu Y.A modified para-nitrophenyl palmitate assay for lipase synthetic activity determination in organic solvent[J].Analytical Biochemistry,2007,363(2):297-299.

[7]拥军.百里香酚兰作指示剂检测辣椒油中的酸价 [J].现代预防医学,2008(10):1905-1906.

[8]郑毅,叶海梅,周虓,等.脂肪酶活力测定研究进展[J].工业微生物,2005(4):36-40.

[9]滕云.酯合成脂肪酶高产菌的选育及其产酶发酵调控的研究[D].无锡:江南大学,2008.

[10]Amaya C L,Stubbs D,Marangoni A G,et al.Assay for Lipase Activity in Organic-Solvents-Lipase-Catalyzed Synthesis of Octyl-Linolenate in a Hexane Microaqueous Reaction System[J].Enzyme and Microbial Technology,1995,17(2):131-135.

[11]孙舒扬.大曲华根霉（Rhizopus chinensis）固态发酵表达酯合成脂肪酶的研究[D].无锡:江南大学,2009.

[12]Gandolfi R.Hydrolytic and synthetic activities of esterases and lipases of non-starter bacteria isolated from cheese surface[J].Annals of Microbiology,2000,50(2):183-189.

[13]Kristensen J B,Xu X B,Mu H L.Diacylglycerol synthesis by enzymatic glycerolysis:Screening of commercially available lipases[J].Journal of the American Oil Chemists Society,2005,82(5):329-334.

[14]Sandoval G.,Marty A.Screening methods for synthetic activity of lipases[J].Enzyme and Microbial Technology,2007,40(3):390-393.

[15]Konarzycka-Bessler M,Bornscheuer U T.A high-throughputscreening method for determining the synthetic activity of hydrolases[J].Angewandte Chemie-International Edition,2003,42(12):1418-1420.

[16]姜新慧,晏日安,曾永青.非水相中脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯[J].食品科技,2010(5):258-261.

[17]李红,陶静,李颖.L-抗坏血酸棕榈酸酯的酶法合成[J].食品工业科技,2011(8):350-352;417.

[18]杨本宏,蔡敬民,吴克,等.非水相中脂肪酶催化合成乙酸正己酯[J].食品工业科技,2006(6):144-147.

[19]Ferrer M.Synthesis of sugar esters in solvent mixtures by lipases from Thermomyces lanuginosus and Candida antarctica B,and their antimicrobial properties[J].Enzyme and Microbial Technology,2005,36(4):391-398.

[20]范卫东,范永仙,陈小龙.用Candida lipolytica脂肪酶手性转酯拆分农药中间体rac-1-苯乙醇 [J].浙江农业科学,2012(12):1689-1692.

[21]戴大章,夏黎明.改性Ultrastable-Y分子筛固定化对非水相中脂肪酶拆分 (R，S)-2-辛醇的影响 [J].化学学报,2008(2):245-250.

[22]杨金明,张敏.单体碳数对脂肪酶N435催化合成直链聚酯的影响[J].合成树脂及塑料,2013(1):48-51.

[23]Numata,K.Branched poly(lactide)synthesized by enzymatic polymerization:Effectsofmolecularbranchesand stereochernistry on enzymatic degradation and alkaline hydrolysis[J].Biomacromolecules,2007,8(10):3115-3125.