羊冷冻精液及输精实用技术

李 莉

（四川省盐边县桐子林镇畜牧兽医站，四川 盐边 617100）

1 采精

用假阴道按常规方法采集精液。采精频率一般为连续采精2d，休息1d。在采精当天，可连续采2次（间隔10～15min）。原精液的活力要求不低于0.8。

2 精液的稀释、分装与冷冻

2.1 冷冻精液稀释液

2.1.1 绵羊冷冻精液稀释液

Ⅰ液：葡萄糖247 mmol/L，磷酸氢二钠10 mmol/L，果糖17mmol/L，磷酸二氢钠10mmol/L，氯化钠49mmol/L，青霉素G500单位/mL，氯化钾 5 mmol/L，链霉素500单位/mL。Ⅱ液：加15%甘油到Ⅰ液中。

2.1.2 山羊冷冻精液稀释液

2.1.2.1 三羟甲基柠檬酸稀释液（Ⅰ液），三羟甲基氨基甲烷 3.319g，链霉素 0.05g，柠檬酸 1.821g，青霉素50 000单位，葡萄糖1 g，加蒸馏水至 100mL，pH 值 7.2。

2.1.2.2 三羟甲基柠檬酸蛋黄稀释液（Ⅱ液），三羟甲基柠檬酸稀释液（Ⅰ液）76%，甘油4%，蛋黄20%。

2.1.2.3 牛奶稀释液，牛奶粉（1%含脂量）10g，青霉素50000单位，葡萄糖100 mL，链霉素50 mg.

2.2 细管精液的稀释、分装与冷冻

2.2.1 绵羊细管精液的稀释、分装与冷冻。采精后，将精液直接冷却至4℃后用Ⅰ液稀释，或先初步稀释（用Ⅰ液）再冷却至4℃，然后再用Ⅱ液以1∶1稀释。稀释后，用5mL注射器在室温下分装于 0.25 mL 或 0.5 mL 细管内，并随即用塑料珠或聚乙烯醇粉封口，置5℃温度下4h，然后将精液冷却到-78℃（在液氮面上方5 cm处），保存于液氮中。

2.2.2 山羊细管精液的稀释、分装与冷冻。将精液置于30～35℃水浴中，用三羟甲基柠檬酸缓冲液稀释精液（精液稀释液体积比为 1∶9），离心 10min，弃去上清液。用牛奶稀释液（无甘油）稀释精液至 800×106个精子/mL（30～35℃）。将样品置于250mL烧杯，在冰箱中放置 1～2h（10℃），然后用含14%甘油的牛奶稀释液稀释精液至 400×106个精子/mL，平衡10 min，用5 mL注射器在室温下分装于 0.25 mL 或 0.5 mL 细管内，并随即用塑料珠或聚乙烯醇粉封口，将细管平行放入盘中，置液氮蒸汽中慢慢冷冻却至-110℃（2min），再放入液氮中保存。

2.3 颗粒精液的冷冻

2.3.1 液氮法。先将液氮注入12磅广口保温瓶内，随后放置漂浮冷冻器（用泡沫塑料及120目铜纱自制而成，直径15cm、高3cm），铜网面积保持低于保温瓶口2～3 cm，以低温温度计测试温度，随时调节漂浮冷冻器铜网面与液氮面的距离（约3 cm），确保铜网面温度保持在-80℃左右，用滴管吸取精液，按每粒0.1 mL滴冻。加盖停留4 min后浸入液氮，用小勺收取。精液分批冷冻第二批滴冻前，需用纱布将铜网面擦净。

2.3.2 干冰法。用特制扎孔器或普通玻璃棒，在预先摊平、压实的干冰上戳上排列整齐的小穴（直径 0.4 cm，深 2～2.5 cm），再用滴管吸取稀释混匀的精液，按0.1 mL容量逐穴滴冻，经4～5mi后即可捡取，存放于液氮中。

2.4 解冻

2.4.1 颗粒精液

2.4.1.1 干解法。将精液颗粒放入灭菌小试管中（每个试管放

粒），在35～40℃水浴中融化至绿豆粒大小时，迅速取出置于手心中轻轻擦动，借助余温全部融化。

2.4.1.2 温解法。将1mL解冻液装入灭菌试管内，置于35～40℃温水中预热，然后投入1粒冻精摇动至融化，取出备用。

2.4.2 细管精液 取细管精液支，置于37℃水浴中轻摇直到变色，取出至全部融化，并立即输精。

3 输精

3.1 输精方法

3.1.1 颗粒精液。采用每1 d次试情，3次输精法。即当天发情母羊于早晚用输精器各输精1次，翌日早晨再输精1次。

3.1.2 细管精液。采用每1d 1次试情，2次输精（早、晚间隔7～8 h），直到发情终止。

3.2 输精标准

3.2.1 颗粒精液。解冻后精子活力不低于 0.3，输精量应为 0.2mL，每一输精剂量中活精子数不少于0.9 亿个。

3.2.2 细管精液。解冻后精子活力在 0.35 以上，输精量为 0.25mL每一输精剂量中活精子数不少于0.7 亿个。