不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞TfR与Lf的表达

李微，董伟杰，刘云霞，庹清章，刘丹霞，张万江

（石河子大学医学院病原生物学免疫学教研室／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002）

铁元素对巨噬细胞内结核分枝杆菌的生存有重要作用，但三者的相互作用机制尚不十分清楚，本实验通过检测不同毒力的结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞转铁蛋白（transferrin receptor，TfR ）和乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）的表达含量，阐明结核分枝杆菌感染巨噬细胞激活了巨噬细胞铁－转铁蛋白－转铁蛋白受体介导的转运铁蛋白结合铁的途径和乳铁蛋白参与的非转运铁蛋白结合铁的途径，使巨噬细胞内的铁稳态发生变化，从而影响结核分枝杆菌的存活及繁殖，旨在为阐明预防结核病发病的机制提供理论基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 细菌

结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌BCG株由中国药物生物制品检定所提供。

1．1．2 细胞

小鼠巨噬细胞株RAW264．7购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1．1．3 主要材料及来源

DMEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（美国 Hyclone公司）；台盼兰（美国Sigma公司）；小鼠转铁蛋白ELISA试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司）；小鼠乳铁蛋白ELISA试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司）；兔抗小鼠转铁蛋白受体抗体（Epitmics公司）；HRP山羊抗兔二抗（北京康为生物有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型建立

H37Rv菌株用0．5mL的生理盐水和苏通培养液混合液（体积比为1∶3）稀释，BCG疫苗每支用0．5mL的专用稀释液稀释，接种于罗氏培养基斜面上，培养至生长达对数期时，取生长状态良好的H37Rv菌株，放于磨菌器中，加少量含0．05%Tween－80的生理盐水研磨均匀，用不含抗生素的DMEM培养液（含10%胎牛血清）稀释成菌悬液，调整细菌浓度为1．0×107／mL。然后用完全培养液DMEM培养RAW264．7细胞，0．25%的胰蛋白酶消化并收获细胞，加入台盼兰染色做活细胞测定，观察活细胞比率＞95%。

显微镜下计数，调整细胞浓度为1．0×106／mL。取6孔细胞培养板，每孔加2mL细胞悬液，置37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h；移去培养液，用预温的不含血清的DMEM培养液洗涤细胞培养板2次，去除非贴壁细胞；每孔加2mL细菌悬液，使细菌与巨噬细胞的比例为10∶1，培养板置37℃、5%CO2培养箱中孵育。

1．2．2 实验分组

实验细胞模型随机分为H37Rv组、BCG组、空白对照组。

1．2．3 ELISA技术动态检测巨噬细胞上清液中TfR和Lf表达量

于模型建立后1、6、12、18、24h分别收集细胞上清液，在4℃离心机中10000r／min离心10min。

1．2．4 ELISA技术检测TfR的表达量

按照小鼠ELISA转铁蛋白受体试剂盒进行操作。按50、40、30、20、10、0ng／mL配制标准工作液，加入到酶标测定板中，100μL／孔。其他孔加入相同体积的待测上清样品，酶标板加盖，37℃反应40 min，洗涤5次，每孔加50μL生物素抗小鼠铁蛋白工作液，37℃反应20min，洗涤3次，加酶标抗体工作液100μL／孔，37℃反应10min，洗涤5次，再加TMB显色液，90μL／孔，37℃避光反应20min，最后加TMB终止液，100μL／孔，酶标仪450nm波长下读取各孔吸光度绘制标准曲线，按标准曲线计算各样本的铁蛋白含量。

1．2．5 ELISA技术检测Lf的表达量

操作步骤同TfR的测定，但标准工作液按100、50、25、10、5、0ng／mL进行配置。

1．2．6 Western blot技术动态检测巨噬细胞内TfR的表达量

提取细胞总蛋白：于模型建立后1、6、12、18、24 h分别提取细胞内的总蛋白。将6孔板中营养液吸干净后，每孔加100μL的SDS蛋白裂解液，冰上裂解30min，而后用小刮子将其刮出，水中煮沸15 min，4℃离心16min，取上清。核酸蛋白测定仪模式调至A280，测定总蛋白的浓度，以浓度最小的所在组蛋白为标准，用裂解液稀释，使得各组蛋白浓度一致。将蛋白质上样缓冲液5μL与蛋白液20μL混匀，然后在水中煮沸10min，冰上冷却5min。

聚丙烯电泳：离心机上4℃13000r／min离心上样液体，5min，取上清上样，80V，30min恒压电泳，待溴酚蓝迁移至分离胶后改为110V，90min恒压电泳。

转膜，转膜前将裁剪好的PVDF膜放在甲醇中浸泡3min，放入转膜缓冲液中，将 Walkman滤纸泡入转膜液约15min。以 Walkman滤纸、聚丙酰胺凝胶、PVDF膜、Walkman滤纸的顺序，23V，恒压半干转膜83min后，将PVDF膜置入含50g／L脱脂奶粉的TBS－T中，封闭2h。

孵一抗：将PVDF膜放入兔源性抗TfR抗体TBS－T 溶液中（1∶1000）4℃孵育过夜。次日：TBST洗涤PVDF膜，10min／次，共3次。PVDF膜放入辣根酶标记山羊抗兔IgG的二抗中（1∶40000），室温孵育1h。TBS－T 洗膜3次，10min／次，用ECL发光试剂进行发光显色，在化学发光成像系统中拍照，用Quantity one软件进行分析。

1．3 统计分析

应用SPSS16．0软件对数据进行统计处理，所得数据均以（¯X±S）表示，组间比较采用方差分析。

2 结果与分析

2．1 小鼠巨噬细胞上清液中TfR蛋白表达水平

结果见图1。

图1 显示，TfR在正常对照组中有少量表达。3个组在1、6、12、18h表达逐渐增强，24h下降。同一时间点H37Rv组、BCG组TfR的表达均高于正常对照组，在12、18h差异具有统计学意义（P＜0．05）。BCG组与 H37Rv组比较，H37Rv组小鼠肺泡巨噬细胞上清液中TfR表达略高于BCG组，但差异无统计学意义。提示，结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞可以增强TfR的表达。

2．2 小鼠巨噬细胞上清液中Lf蛋白表达水平

结果见图2。

由图2可知，正常巨噬细胞分泌少量的Lf，但在各时间点检测表达量逐渐增强，同一时间点各组比较，结果表明，H37Rv组、BCG组的表达均高于正常对照组，在6、12、18、24h均有统计学意义（P＜0．05），其中24h差异最大。各个时间点BCG组与H37Rv组比较，H37Rv组小鼠肺泡巨噬细胞上清液中Lf表达略高于BCG组，但差异无统计学意义。由此表明，感染增强了巨噬细胞Lf的分泌。

2．3 小鼠巨噬细胞中TfR蛋白表达水平

结果如图3所示。

图3和图4显示，用 Western blot检测各组小鼠巨噬细胞内 TfR在1、6、12、18、24h的蛋白表达水平，在分子质量单位约95Kd处各有1条特异性蛋白带，统计学分析表达结果为：H37Rv组＞BCG组＞正常对照组，且在1、6、18h有统计学意义（P＜0．05）。提示结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞诱导TfR的表达增高，且表达与毒力相关，毒力越强TfR表达越高。

3 讨论

人的单核细胞可以通过转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TfR1）介导的途径来获取转铁蛋白（transferrin，Tf）结合的。TfR1是1个跨膜的二聚糖蛋白，每个亚基结合1个Tf（Fe3＋）2后内吞形成内吞小泡，在内吞小泡里Fe3＋被释放出来。进一步研究发现，培养的单核细胞分化成巨噬细胞后，TfR1的表达显著增加。细胞内的铁水平与TfR表达呈负相关，其机制为：细胞内铁水平调控TfR1的表达主要是通过铁反应元件 （iron－responsiveelement，IRE）和铁调节蛋白 （iron－regulatory protein，IRP）介导的转录后水平的调控来调节，IRP能够感受细胞内游离铁水平的变化，通过与IRE的结合或解离来调节具有IRE结构的铁代谢相关蛋白mRNA的稳定性，进而调节蛋白的表达量。TfR1mRNA 3′－UTR含有5个IREs，当细胞内铁缺乏时，IRP与TfR1mRNA 3′－URT 的IRE 结合，减少了TfRmRNA的降解，TfR表达量增加。反之，当细胞内铁水平增加时，则出现相反的结果［1－2］。

Chart报道，活化的小鼠巨噬细胞产生的NO能有效杀死致病的结核分枝杆菌。在炎症应答反应中，iNOS诱导产生的NO，当NO合成增加时，活化IRP，使之与IRE结合，增加了TfR的表达，降低了Fn的合成，通过增加铁摄取，导致细胞内的铁浓度上升。巨噬细胞还可以通过膜上TfR1介导内吞作用，吸收转铁蛋白结合的铁（transferrin bound iron，TBI）；在一些促炎症因子刺激下，二价金属离子转运体 （Divalent metal transporter1，DMT1）表达上调，促进巨噬细胞对非转铁蛋白结合的铁（nontransferrin bound iron，NTBI）的吸收［3］。在感染早期TFR1的上调是由翻译后调节介导的，并随着IRP1和IRP2表达的增加而增加。TFR1表达的增加通过转铁蛋白介导的铁运输扩充了细胞内动态铁池，使弗朗西斯菌易于获取铁［2］。转铁蛋白受体的下调不影响细菌与其他膜蛋白的结合而入侵，但抑制细菌在细胞内的增殖。

本实验利用ELISA技术和 Western blot技术动态监测不同毒力的结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞TfR的表达，结果显示感染诱导了巨噬细胞TfR的表达，即驱动了转铁蛋白介导的铁吸收程序。另外，本实验前期研究发现，结核分枝杆菌感染后，巨噬细胞内Fn在1、6、12、18、24h表达逐渐增强，进一步证实了与本实验研究结果一致。Western blot结果显示，巨噬细胞内的TfR与毒力呈正相关，毒力越强TfR表达越高。分析可能与不同毒力的MTB感染巨噬细胞后可诱导宿主细胞产生不同的转归有关：高毒力结核菌株 H37Rv能够抑制细胞凋亡，在胞内存活、繁殖、扩散，导致细胞坏死，进而引发炎症反应、细菌扩散，而H37Ra、BCG等减毒株则能诱导宿主细胞产生大量凋亡［4］。

乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）是一种分子量为70－80KD的糖蛋白，是高亲和性的铁结合蛋白，在巨噬细胞中参与非转运铁蛋白结合铁的途径来调控细胞内的铁代谢［5］。乳铁蛋白分子中含有2个六配位金属结合位点，可牢固结合2个铁离子，多余铁离子是与乳铁蛋白靠静电力作用结合。人的小肠粘膜细胞表面有特殊乳铁蛋白受体（Lactoferrin Receptor，LfR）与乳铁蛋白结合，当乳铁蛋白到达肠道后，识别并特异结合细胞表面LfR，进入细胞内部释放出Fe3＋。当细胞内缺铁时，细胞表面LfR增多，从而增加乳铁蛋白与其受体结合机会，在补充铁时结合使用乳铁蛋白不仅可降低有效铁使用量，也可避免游离铁对肠道直接刺激作用，铁的这种高吸收性主要在于乳铁蛋白铁的高溶解性或Fe－Lf中铁的特殊吸收机制［6］。

乳铁蛋白具有调节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成的能力，机体感染时会产生6～20倍以上的乳铁蛋白参与抗菌过程。张英华等［7］研究在磷酸根存在中性条件下乳铁蛋白对铁离子溶解作用影响，发现乳铁蛋白对二价铁和三价铁均具有显著增溶作用，可使铁溶解度提高60～70倍，远远超过其分子含铁量。另有结果表明，乳铁蛋白不仅可显著增加无机铁离子在肠道环境条件下溶解度，且由于乳铁蛋白中铁的高稳定性及其以氨基酸铁形式被吸收的特殊吸收方式，使其必然能促进机体对铁的吸收。

Lf是铁结合性糖蛋白，它可以与病原性微生物竞争性地结合铁离子，因为病原菌的毒性与其从环境中获取铁离子有关。除乳酸杆菌外，几乎所有细菌的生长都需要铁，铁离子对细菌中生物氧化酶是必需的Lf与之竞争铁造成微生物生长的铁缺乏环境，从而导致病原微生物的死亡［8］。缺铁型Lf（apo－lactoferrin）即通过与需铁细菌争夺可利用铁而达到抑菌的目的。乳铁蛋白表达量增高可增强单核吞噬细胞对微生物的吞噬和对胞内寄生菌的杀伤作用，主要作用机制分为两种：（1）脱铁形式的乳铁蛋白，通过结合铁离子，抑制被吞噬细菌在胞内生长，从而促进嗜中性粒细胞对细菌的杀伤；（2）在胞内吞噬溶酶体中的酸性环境条件下，鳌合铁离子的乳铁蛋白，可通过提供游离铁离子，催化自由基的生成，从而对吞噬溶酶体内的微生物产生杀伤作用［9］。

本实验应用ELISA技术动态监测1h－24h内小鼠肺泡巨噬细胞内Lf蛋白的表达，结果显示：H37Rv组、BCG组的表达量均高于正常对照组，提示感染激活了非转运铁蛋白结合铁的途径，使得细胞内的铁增多，与上述结果一致。推测结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞后，大量表达Lf可能杀伤寄生在宿主内结核分枝杆菌，这为防治结核病提供个新的思路。

结核杆菌感染宿主巨噬细胞后，一方面要从感染宿主巨噬细胞内摄取一定量的铁，以保证自身在宿主巨噬细胞内的生存、繁殖和分化的需要，使得巨噬细胞内的游离铁离子减少，此时巨噬细胞摄铁途径铁－转铁蛋白－转铁蛋白受体介导的转运铁蛋白结合铁的途径和乳铁蛋白参与的非转运铁蛋白结合铁途径被激活，同时细胞膜上的膜转运蛋白（Ferroportin，FPN）转出途径被抑制［10］，使得巨噬细胞内的Fn的表达量上升。这为结核分枝杆菌生的生存提供了足够的铁元素；另一方面，细胞中铁过载，超过了铁蛋白的结合能力，使游离铁在铁池中大幅度增加，通过与细胞内的有机化合物结合，产生高反应铁或高铁离子，进而损伤溶酶体膜和线粒体膜；并且铁可作为一种强力催化剂，促进氧自由基的产生，导致细胞膜及细胞器膜磷脂过氧化反应，特别是对线粒体膜和微粒体膜的过氧化损伤，进而通过干扰电子转移等而导致能量产生减少，最终导致细胞的应激和／或凋亡或死亡［11－12］。所以，研究不同毒力的结核杆菌对感染宿主巨噬细胞铁代谢的调控作用机制，对结核病的有效防治提供了新的理论依据，对结核病的防治有重要的意义。

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