通脉活络胶囊的制备及对血栓性疾病治疗的药理作用实验探讨

陈艳红

（山东省莱芜市人民医院 山东 莱芜 271100）

近年来以冠脉血栓和脑血栓为主的血栓栓塞性疾病的发病率呈上升趋势，静脉血栓栓塞导致的死亡排在心脑血管疾病和恶性肿瘤之后的第三位，严重危害人类的健康。因此，寻求积极的预防及治疗方法尤为重要，该研究通过做动物实验的方法，观察通脉活络胶囊治疗血栓性疾病的实验数据，进一步探讨其作用机理，为临床应用提供安全、有效的方法，该研究的目的通过观察通脉活络胶囊的工艺制备，探讨其质量控制标准，为临床应用提供质量保证，以获得治疗血栓性疾病的药理作用实验数据。采用寒冷刺激加肾上腺素造成血瘀模型等方法，观察通脉活络胶囊的毒理、药理的作用机制。研究如下：

1 制备工艺

1.1 处方组成：通脉活络胶囊的药物组成：僵蚕9g，水蛭9g，海风藤12g，陈皮12g，泽泻9g，猪苓9g，续断9g，泽兰12g，牛膝9g，丹参12g，川芎12g，赤芍12g，红花12g，桃仁10g。

1.2 制备工艺

1.2.1 制备方法：将以上中药一十司味，如法炮制，烘干，配料、粉碎过100目筛，混匀，装0号胶囊使每粒胶囊装0.4g的药粉，即得。

1.2.2 生产工艺流程：炮制→配料→烘干→粉碎→过100目筛→混匀→装0号胶囊→包装→检验→合格→入库。

1.3 质量控制

［性状］本品为胶囊剂，其内容物为浅黄色粉末、味苦。

［鉴别］取本品内容物粉末2g，加石油醚（60-90℃）10 ml，超声处理30分钟，滤过、滤液蒸干，残渣加石油醚（60-90℃）1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取赤芍对照药材l g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（附录VIB）试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅酸G薄层板上，以石油醚（60-90℃）一乙酸乙酯一醋酸（10：3：0.1）为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯（365n m）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。

［含量测定］水蛭含量测定照高效液相色谱法（参阅中国药典2005版附录ⅥD）测定.色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇0.05 mol／L磷酸二氢钾溶液一醋酸一异丙醇（67∶173∶4∶4）为流动相；检测波长为230n m.理论板数按水蛭素峰计算应不低于1500.对照品溶液的制备：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的水蛭素对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，摇匀，即得。供试品溶液的制备：取该品中粉约0.5g，精密称定，置20 ml量瓶中，加甲醇约18 ml，浸泡4小时，超声处理（功率150 W，频率20k Hz）30分钟，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μI，注入液相色谱仪，测定，即得。该品含水蛭素（C23 H28O11）不得少于0.80%.

［检查］本品应符合胶囊剂项下有关的各项规定（参照《中国药典》2005年版一部附录IL）。

2 动物实验药理作用研究

2.1 实验材料

2.1.1 药品：通脉活络胶囊（处方组成：僵蚕9g，水蛭9g，海风藤12g，陈皮12g，泽泻9g，猪苓9g，续断9g，泽兰12g，牛膝9g，丹参12g，川芎12g，赤芍12g，红花12g，桃仁10g）。将以上中药按照配方配料，先行炮制、烘干、粉碎、过100目筛、混匀，取上述药粉装0号胶囊，使每粒胶囊装药粉0.4g即得。临用前用蒸馏水配成不同浓度备用。

2.1.2 阳性对照药：消栓通络片，批号：20100601。

2.1.3 试剂：戊巴比妥钠，国药集团化学试剂有限公司，批号WS20080401；胶原蛋白，Sig ma，批号：9879；盐酸肾上腺素.批号：0809301；冰醋酸，批号：08083l；氢氧化钠，批号：2008228；活化部分凝血活酶（APTT）时间测定试剂盒，北京世堂帝科学仪器公司，批号：STG2020l-27；凝血活酶原（TT）时间测定试剂盒，北京世帝科学仪器公司，批号：STG10101-27；凝血酶（TT）时间测定试剂盒，北京世帝科学仪器公司，批号STG20802-19；血小板诱导剂（ADP），北京世帝科学仪器公司。

2.1.4 动物：二级昆明种小鼠，雄雌各半，体重1 8～22g；SD大鼠，雌雄各半，体重250～350g，均由市药检所实验动物研究中心提供，生产合格征号：鲁第2011-005号。

2.2 方法

2.2.1 通脉活络胶囊对凝血功能的模型制备：60只小鼠随机分为正常、阳性、消栓通0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五组，每组12只，每天给药1次，连续给药14d，于末次给药后1h，将小鼠尾尖1 c m处用利剪剪断，它即秒表开始计时，至血液凝固为止即为出血时间［1］。血液自动流出.用滤纸吸去第1滴血后，将血滴于清洁载玻片两端各1滴，立即秒表开始计时，用6号干燥针头沿血滴边缘向里轻轻挑动血滴，至针头能挑起纤维蛋白丝为止.即为凝血时间。

2.2.2 通脉活络胶囊对血瘀大鼠血小板聚集率及凝血因子的模型制备：60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组、通脉活络胶囊0.20g／kg、0.40g／kg、0.80g／kg六个剂量组，除正常对照组外，各组均造成血瘀模型。造模：参照文献［2］复制血瘀模型，但盐酸肾上腺素（Adr）的剂量及冰冻时间有所改变，具体操作如下：将1 mg／mL的Adr用生理盐水稀释1倍，第1d每隔4h皮下注射0.2 mL稀释后的Adr，共给3次。在每2次给药的中间时间将大鼠放入0～2℃冰水中4 min进行冷刺激；第2d仍按的日剂量给予2次Adr（间隔4h），在2次给药的中间时间将大鼠放入冰水中3 min进行1次冷刺激，模型即造成。48h后大鼠1%戊巴比妥钠（40 mg／kg）行腹腔麻醉，腹腔静脉取血，置于3.8枸橼酸钠抗凝管中。离心，测定血小板聚集率和凝血因子［3］。

2.2.3 通脉活络胶囊对胶原蛋白肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成的模型制备：取小鼠60只，雌雄各半，随机分成正常组、阳性组、通脉活络胶囊0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五组，给药14d，各组于末次给药后1h，每只小鼠尾静脉注射胶原蛋白肾上腺素混合血栓诱导剂［4］。

3 结果

3.1 通脉活络胶囊对凝血功能的影响比较：结果（见表1）显示通脉活络胶囊0.50g／kg、1.00g／kg给药14d与正常对照组比较，有明显延长小鼠凝血及出血时间的趋势（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 通脉活络胶囊小鼠凝血时间的影响(±s，n=12）

表1 通脉活络胶囊小鼠凝血时间的影响(±s，n=12）

注：与对照组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01.

组别 n 剂量（g／kg） 出血时间（s） 凝血时间（s）正常组12 - 1150.58±40.52 127.75±65.92小剂量组 12 0.25 1225.00±38.00 171.80±67.51中剂量组 12 0.50 1528.70±40.15▲ 183.70±37.94△大剂量组 12 1.00 1550.00±44.38▲ 215.18±99.71△阳性组 12 1.00 1403.18±39.51△ 2.4.18±82.52△

3.2 通脉活络胶囊对血瘀大鼠血小板聚集率及凝血因子的影响比较：结果（见表2～3）与正常组比较，模型组血液中TT、PT、APTT内源性和外源性凝血功能明显缩短，血小板聚集率显著增高；通脉活络胶囊0.20g／kg、0.40g／kg、0.80g／kg均能明显降低血瘀高凝大鼠模型Ⅱ因子活性，降低血小板聚集率，抑制内源性和外源性凝血系统，降低血液高凝状态，与模型组比较有明显差异（P＜0.05或P＜0.01）。

3.3 通脉活络胶囊对胶原蛋白肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成的影响比较 取小鼠60只，雌雄各半，随机分成正常组、阳性组、通脉活络胶囊0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五组，给药14d，各组于末次给药后1h，每只小鼠尾静脉注射胶原蛋白肾上腺素混合血栓诱导剂［5］，结果（见表4）表明通脉活络胶囊0.50g／kg、1.00g／kg给药1 4d与模型组比较，能明显增加小鼠存活率（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 通脉活络胶囊血瘀大鼠的血小板聚集率的影响(±s，n=10）

表2 通脉活络胶囊血瘀大鼠的血小板聚集率的影响(±s，n=10）

注：与正常组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01与模型组比较，◇P＜0.05，◆P＜0.01。

组别 n 剂量（g／kg） 血小板聚集率（%）正常组10 - 16.73±3.04模型组 10 - 27.36±4.68▲小剂量组 10 0.20 21.26±2.14△◇中剂量组 10 0.40 19.13±3.55▲大剂量组 10 0.80 18.55±3.20◆阳性组 10 0.80 23.24±2.82▲◇

表3 通脉活络胶囊血瘀大鼠凝血因子的影响 （±s，n=10）

表3 通脉活络胶囊血瘀大鼠凝血因子的影响 （±s，n=10）

组别 剂量 TT（s） PT（s） APTT（s）正常组- 30.06±2.78 15.21±1.90 36.84±3.91模型组 - 20.25±7.83▲ 7.40±0.35▲ 25.93±2.09▲小剂量组 0.20g／kg 28.05±5.19◇ 11.20±1.07◇ 30.81±3.39◇中剂量组 0.40g／kg 30.74±3.09◆ 14.76±1.33◆ 36.01±2.49◆大剂量组 0.80g／kg 29.30±2.68◆ 15.10±1.50◆ 37.25±1.34◆阳性组 0.80g／kg 27.16±3.38△◇ 17.38±1.77△◇ 35.00±2.32◆

表4 通脉活络胶囊对小鼠体内血栓形成的影响（n=12）

4 讨论

4.1 病因和发病机制：本病的病因及发病机制十分复杂，迄今尚未完全明确，但近年的研究表明血栓性疾病的发生、发展主要与下列6种因素有关：血管内皮损伤当血管内皮细胞因机械（如动脉粥样硬化）、化学（如药物）、生物（如内毒素）、免疫及血管自身病变等因素受损伤时，可促使血栓形成。其发病机制为：①内皮损伤、内皮细胞TF过度表达及释放，外源性凝血途径激活；②血管完整性破坏，FⅦ激活，内源性凝血途径启动；③血小板粘附、聚集、释放反应增加；④内皮细胞受损，ET释放，致血管收缩、血流受阻。血小板数量增加，活性增强各种导致血小板数量增加、活性增强的因素，均有诱发、促进血栓性疾病发生的可能性，如血小板增多症、机械、化学、生物及免疫反应等导致的血小板破坏加速等。其致病机制与激活凝血反应等密切相关，详见本篇第十五章。目前认为，血小板因素在动脉血栓形成（如心肌梗死）的发病中有更为重要的地位。血液凝固性增高在多种生理及病理状态下，人体凝血活性可显著增强，表现为某些凝血因子水平升高或活性增加，如妊娠、高龄及创伤感染等所致的应激反应、高脂血症、恶性肿瘤等。而高凝状态是血栓性疾病的发病基础。抗凝活性减低人体生理性抗凝活性减低，是血栓形成的重要条件。引起人体抗激活性减低的常见原因有：①AT减少或缺乏；②PC及PS缺乏症；③由FV等结构异常引起的抗蛋白C现象（APC-R），近年研究发现，在欧美白人反复发生深部静脉血栓形成或有阳性家族史的深部静脉血栓形成（DVT）患者中，APC-R的发生率高达60%；④肝素辅因子Ⅱ（HC-Ⅱ）缺乏症等。纤溶活力降低临床常见有：①纤溶酶原结构或功能异常，如异常纤溶酶原血症等；②纤溶酶原激活剂（PA）释放障碍；③纤溶酶活化剂抑制物过多。这些因素导致人体对纤维蛋白的清除能力下降，有利于血栓形成及扩大。血液流变学异常各种原因引起的血液粘滞度增高、红细胞变形能力下降等，均可导致全身或局部血流淤滞、缓慢，为血栓形成创造条件。如高纤维蛋白原血症、高脂血症、脱水、红细胞增多症等。它可通过以下机制促进血栓形成：①红细胞聚集成团，形成红色血栓；②促进血小板与内皮的粘附及聚集，增强血小板活性；③损伤血管内皮，启动凝血过程。

4.2 中医药理探讨：现代医学认为，与本病有关的因素有静脉血流滞缓、静脉壁损伤、血液的高凝状态及妊娠分娩、肥胖、老年、心脏病、恶性肿瘤、口服避孕药等。本病相当于中医学的“股肿”，是由创伤、手术、妊娠、分娩、恶性肿瘤及因其它疾病而长期卧床，或长途乘车，以致久卧伤气，血行缓慢，以致瘀血阻于脉中；或因饮食不节，素食膏粱厚味，湿热内生，流注于血脉，湿热与瘀血互结，阻于络道所致。脉络滞塞不通，不通则痛；营血回流受阻，水津外溢，聚而为湿，停滞于肌肤则肿；血瘀脉中，瘀久化热，故患肢温度升高。总之，络脉血凝湿阻是本病的主要病机。针对这一病机，急性期在应用尿激酶溶栓抗凝的同时，以中医通脉活血、利湿消肿为治疗原则，自拟通脉活络胶囊治疗。方中桃仁、红花、水蛭、赤芍、川芎、丹参活血化瘀通脉，其中川芎行血活血，走而不守；用泽兰、取其行气利水消肿、活血化瘀通脉的双重功效，且行而不峻，祛瘀而不伤正，对肢体肿胀疗效明显；陈皮理气行气，使气行则血行，血行脉自通；泽泻、猪苓淡渗利湿消肿；牛膝引诸药直达病所；僵蚕、海风藤祛风定惊，散结止痛；续断有补肝肾、强筋骨、调血脉。诸药合用，共达通脉活血、利湿消肿之目的。辨病和辨证相结合，以病为纲，病证合参，提高了疗效，发病后能迅速控制病情，使静脉再通，不遗留后遗症或少留后遗症，既缩短了病程，也降低了病残率。

［1］中华人民共和国卫生部药政管理局中药新药研究指南（药学药理学毒理学）：［M］.2004：172

［2］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2004：564-566

［3］张强宗，刘俊田，史小莲，等.水蛭免加热提取物对高凝动物模型凝血系统及血小板聚集率的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2006。1 2（5）：47-49

［4］谢辉.许惠琴.李虹.韭白向提取物对小鼠凝血时间及体内血栓形成的影响［J］时珍国医国药.2004.1 5（1 2）：811-812

［5］陈领朝，连秀峰.袁秉祥，等.脑络舒通胶囊对大鼠实验性脑及动静脉血栓形成的药效与研究［J］.陕西中医.2002，23（4）376-377