T-2毒素研究进展

刘 磊，张国巍，丁 博，王会岩 (吉林医药学院检验学院，吉林 吉林 132013)

T-2毒素是由镰刀菌在特定条件下产生的单端孢霉烯族毒素，广泛分布于自然界，是污染田间作物和库存谷物的主要毒素，1968年bamburg首次分离提纯得到T-2毒素结晶，并确定化学结构。1973年联合国粮农业组织(FAQ)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上，已将这类毒素同黄曲霉毒素一样列为天然存在的最危险的食品污染源。近年来，研究发现人类食管癌、地方性肾病、食物中毒性白细胞缺乏病(ATA)、克山病和大骨节病的病因可能与单端孢霉烯族毒素的污染密切相关［1-3］。自此有关T-2毒素对人类健康的危害引起了各国科学家的关注。近几年，国内围绕T-2毒素进行了大量的研究工作，取得了很大进展。本文就T-2毒素的产生、理化性质、检测方法及毒性作用等方面进行综述。

1 产毒菌株

T-2毒素主要来自镰刀菌属，如三线镰刀菌(F.tricinctum)、拟枝孢镰刀菌(F.sporotrichioides)、梨孢镰刀菌(F.poae)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)等均能产生T-2毒素。其产毒能力受菌属种类、温度、湿度、pH、蛋白、糖和光照等因素的影响［4］。Burmeister和Wyatt等［5-6］研究三线镰孢菌，于15℃培养3周，可获得大量的T-2毒素。匡开源等［7］研究三线镰刀菌M-20在5～15℃下，培养四周产毒能力最强。Rukhyada VV等［8］研究拟枝孢镰刀菌在湿度40%～50%，温度3～7℃条件下，玉米和黑麦中产毒能力最强。代喆等［9］研究梨孢镰孢菌在液体培养中产毒，最佳条件为8～25℃间隔12 h变温、前期光照后期黑暗、前期振荡后期静止培养28 d，可获得一定量的T-2毒素。

2 理化性质

T-2毒素是一种倍半萜烯化合物，化学名为4β-15-二乙酰氧基-3α-羟基-8α-(3-甲基丁酰氧)-12，13-环氧单端孢霉-9-烯，分子式为C24H34O9，相对分子质量为466.22。纯品为白色针状晶体，难溶于水，易溶于甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮等极性有机溶剂，性质稳定，在室温下放置6～7年或加热至100～120℃1～2 h，毒性不会减弱，而在碱性条件下可失去毒性。T-2毒素几乎对所有的真核生物，包括植物、动物及人类均具有一定的毒性［10-11］，Baltriukiene等［12］研究表明其毒性与结构中的环氧基团和双键有关。

3 分析检测方法

关于T-2毒素的检测方法有很多，随着检测技术的不断发展，目前应用比较广泛的测定方法有气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-mass spectrometry，LC-MS)和免疫法。其中，液相色谱-质谱联用技术由于不需要针对T-2毒素进行衍生化处理，且有较高的灵敏度和特异性，目前已成为包括T-2毒素在内的单端孢霉烯族真菌毒素的最为广泛的分析检测方法。

3.1 气相色谱法

气相色谱法具有高灵敏度、高分离效能、高选择性等优点。气相色谱仪可与电子捕获检测器(Electron capture detection，ECD)、火焰离子化检测器(Flame ionization detection，FID)等是目前分析检测单端孢霉烯族毒素最广泛的方法。T-2毒素自身并不具挥发性，因此，使用GC检测时，一般需要以硅烷化或氟酰基化试剂进行衍生化处理。Valle-Algarra等［13］采用GC-ECD方法对辣椒中T-2毒素进行分析检测，最低检测限为7μg/kg，回收率为71.1%。Kong等［14］建立了灵敏度高的GC-ECD检测方法，检测中药中的T-2、HT-2毒素，样品经七氟丁酰咪唑衍生化后检测，最低检测限为1.88μg/kg，回收率为89.2%～99.1%。Eke等［15］建立GC-FID方法检测粗麦粉和粗玉米粉中T-2毒素，以双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生化试剂，其最低检测限分别为0.3μg/kg和0.47μg/kg。

3.2 高效液相色谱法

由于T-2等A型单端孢霉烯族毒素没有紫外吸收，要采用HPLC法进行测定，必须通过柱前或柱后衍生化处理才能进行检测。目前，比较常用的是通过柱前衍生化为其加上荧光基团，再采用高灵敏度的荧光检测法进行测定，该方法被广泛使用。Jimenez等［16］以coumarin-3-carbonyl chloride为衍生化试剂，对衍生化条件进行了考察优化，并对3种不同的净化方法(硅胶柱、C18SPE柱和液液萃取法)进行了考察，最后确定液液萃取为最佳的净化方法。该方法对T-2毒素的最低检测限为10 ng/g。Schothorst等［17］将T-2毒素衍生化后，进行LC-荧光法检测，其最低检测限为0.6μg/kg。Lippolis等［18］对3种荧光标记试剂［1-naphthoyl chloride(l-NC)，2-naphthoyl chloride(2-NC)和pyrene-1-carbonyl cyanide(PCC)］进行了比较，结果表明采用2-NC和PCC作为荧光试剂灵敏度和选择性更好，对T-2毒素的最低检测限分别为6.3 ng/kg和2.0 ng/kg。

3.3 色谱-质谱联用技术

色谱联用技术主要是使用合适的接口技术将气相色谱仪、高效液相色谱仪与质谱仪等联结起来，从而可以达到同时进行定性和定量检测，对于初级监测呈阳性反应的样品进行在线确证，有很大的优势。其中液相色谱-质谱联用技术(LC-mass spectrometry，LC-MS)由于不需要针对T-2毒素进行衍生化处理，且有较高的灵敏度和特异性，目前已成为包括T-2毒素在内的单端孢霉烯族真菌毒素的最为广泛的分析检测方法。Sørensen等［19］采用LC-MS/MS法分析了牛奶中的T-2毒素，采用正离子模式检测，其最低检测限为0.4μg/L，回收率为92%～101%。De Baere等［20］使用LC-MS/MS法，对猪和火鸡的血浆、胆汁中的T-2毒素进行定量分析，最低检测限分别为0.01μg/L和0.06μg/L。LC-三重四级杆-线性离子阱质谱［LC-hybrid triple quadrupole-linear ion trap MS(LC-QTrap/MS)］具有较高的灵敏度及同时定量定性分析的优点，是一种较好的单端孢霉烯族真菌毒素分析方法。Rubert等［21］应用该法，对27份志愿者的尿液进行了11种真菌毒素的分析检测，T-2毒素的最低检测限为2μg/L。

3.4 免疫法

酶联免疫吸附分析法(Enzyme linked adsorption immunoassay，ELISA)与GC、HPLC法等相比，具有样品前处理简单、快速方便、特异性和灵敏度高且不需要昂贵的仪器设备及可以现场在线检测等特点，比较适合推广普及。T-2毒素分子量较小，本身无免疫原性，只有其与载体蛋白结合之后，才具有免疫原性。曹艳红等［22］在自制T-2毒素酶标半抗原的基础上，结合市售抗T-2毒素单克隆抗体，建立了检测谷物中T-2毒素的直接竞争性酶联免疫吸附测定法，该方法最低检出限为0.125 ng/mL。Wang等［23］建立了直接竞争免疫芯片法，对饮料中6种毒素进行定量检测，目视范围内可达到半定量检测。其中T-2毒素的最低检出限为0.05μg/L。但是，该方法仍存在一些缺点，如抗体制备复杂，交叉反应及非特异性反应干扰严重，从而导致假阳性概率较高。

4 T-2毒素的毒性研究

T-2毒素是单端孢霉烯族化合物中毒性最强的一种，可通过多种途径对人和动物的多种组织和器官产生毒害作用，它主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官。研究表明，T-2毒素能够引起的毒性效应包括消化系统和肝脏毒性、骨系统损伤、基因与细胞毒性、血液系统毒性、免疫系统毒性、神经毒性和生殖发育毒性等。

4.1 消化系统和肝脏毒性

T-2毒素进入动物消化道，破坏消化道黏膜的完整性，影响营养物质的吸收，同时，家禽的口腔、胃、肠道也可见坏死性病变［24］。T-2毒素在体内的重要损害部位之一是肝脏。抑制肝细胞蛋白质合成和酶类物质的活性，降低肝脏对有毒物质的代谢作用，诱导肝脏脂质过氧化，损伤膜的结构和功能，使肝细胞凋亡［25］。兔子和大鼠口服一定剂量的T-2毒素后，肝脏谷胱甘肽巯基转移酶(GSTs)和微粒体细胞色素P450酶的表达与活性下降，同时大鼠肝脏脂质过氧化水平和抗氧化酶活性增强［26-27］。

4.2 骨系统损伤

T-2毒素可引起动物骨发育不良，骨质减少，影响软骨内和骨膜内骨化，以及骨相关肌肉和神经系统的紊乱等。T-2毒素作用怀孕第9天的大鼠可引起胎儿肋骨与脊椎骨畸形［28］。T-2毒素还可以诱导软骨细胞IL-lβ与IL-6分泌，8μg T-2毒素通过诱导ILlβ与IL-6影响软骨细胞发育，引起软骨细胞凋亡［29］。T-2毒素能明显增加软骨细胞一氧化氮合酶蛋白表达，表达量与T-2毒素的浓度成正比，表明T-2毒素引起的软骨细胞损伤与合成一氧化氮增多有关［30］。

4.3 基因与细胞毒性

T-2毒素抑制细胞蛋白质、DNA和RNA合成，引发细胞氧化应激导致DNA损伤，诱导细胞凋亡、基因表达变化和细胞膜功能损伤等。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的丝裂原活化蛋白激酶(P38)或c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路被激活从而导致蛋白质合成受抑制［31-32］。细胞氧化过程中活性氧(ROS)的过量生成可引起机体的氧化应激反应。不能及时清除的ROS作用于DNA可导致DNA氧化损伤。T-2毒素还可以通过调节与凋亡相关基因的表达来诱导细胞凋亡。Albarenque等［33］研究T-2毒素致大鼠皮肤以及体外培养角质形成细胞原代细胞的试验中，发现该细胞中与氧化应激、凋亡相关的原癌基因c-fos、c-jun的表达量增加，从而激活相应的信号通路引起凋亡。

4.4 血液系统毒性

T-2毒素可引起血小板和白细胞减少，伤口凝血能力减弱、抗感染能力下降，血细胞凋亡和骨髓坏死，严重时还可导致败血病。此外，T-2毒素还与ATA有关。Bennett等［34］曾报道二战期间士兵食用了T-2毒素污染的食物后患上致命的食物中毒性白细胞缺乏症。T-2毒素可毒害定向造血干细胞，比如粒细胞、单核细胞和红细胞集落形成细胞。研究发现T-2毒素是通过调节磷脂代谢(如促进磷脂酶水解血小板膜磷脂)来抑制血小板的聚集作用［35］。另外，T-2毒素还可通过抑制凝血因子Ⅶ活性和依赖凝血酶原的纤维蛋白原活化过程导致家禽产生凝血病［36］。

4.5 免疫系统毒性

低剂量的T-2毒素具有免疫刺激作用，引起血清中IgA和IgE抗体水平增加，从而增强机体的免疫功能。高剂量情况下，白细胞减少，骨髓、淋巴结、脾脏和胸腺等免疫器官与组织受到损伤，从而导致机体免疫功能下降［37］。T-2毒素可能通过影响细胞因子来调节机体免疫功能。Meissonnier等［38］研究T-2毒素亚急性暴露实验中细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ均未发生变化。由于免疫系统本身的复杂性，即使实验条件类似，所得到的T-2毒素免疫毒性结果也不完全一致。因此，T-2毒素对动物免疫系统毒效应的复杂过程还有待我们进一步深入研究。

4.6 神经毒性

T-2毒素可损害血脑屏障，影响中枢神经系统，发挥神经毒作用。注射T-2毒素后，端脑区神经母细胞的凋亡数目明显增多。通过实时定量PCR发现，T-2毒素主要是通过诱导氧化应激，然后通过促分裂原活化蛋白激酶路径诱导脑细胞的凋亡［39］。1.5 mg/kg和6 mg/kg的T-2毒素急性暴露SD大鼠，可导致其大脑皮层与纹状体RNA耗竭和大脑皮层的神经元蛋白水平下降［40］。T-2毒素还可通过改变血脑屏障通透性、抑制蛋白合成和降低单胺氧化酶活性引发小鼠神经化学物质失衡［41］。此外T-2毒素可诱导大脑中神经小分子变化和血清素活性变化，致使动物食欲下降和肌肉协调产生问题［42］。

4.7 生殖发育毒性

早期研究认为T-2毒素对胚胎的毒性是继母体毒性之后发生，而Ishigami等［43］用3 mg/kg的T-2毒素暴露受孕小鼠却发现T-2毒素对胎鼠组织产生直接的细胞毒性，造成中枢神经和骨骼系统细胞凋亡。一般认为，T-2毒素诱导具有高增殖活性的细胞凋亡，但Ishigami等［44］在增殖细胞核抗原阳性细胞测试结果为阴性的区域发现了凋亡细胞，说明T-2毒素对胎鼠的细胞毒性还受其他因素的影响。

5 研究展望

目前，T-2毒素在全球范围内已经广泛分布，范围已覆盖全球。欧洲、美洲、亚洲，连续出现T-2毒素的中毒现象，对人类和动物健康的潜在危害已不容忽视，已经引起了全球各国的高度关注。因此，在掌握了解T-2毒素的产生、理化性质、检测技术的基础上，选择快速有效的检测方法，全面开展T-2毒素污染的生态安全性评价迫在眉睫。另外通过研究T-2毒素的毒性作用，特别是能够引起细胞的凋亡，给我们提供了一个新的科研思路。

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