肌成纤维细胞在纤维化疾病中的研究进展

于天水 官大威 马 勇 张冬梅

（1中国政法大学证据科学教育部重点实验室，北京 100040；2中国医科大学法医学院，沈阳 110001；3大连市金州区65066部队门诊部，辽宁 大连 116100）

1971年，Gabbiani［1］和 Majno［2］在创伤愈合研究中发现肉芽组织中的成纤维细胞表现出平滑肌细胞的结构特征。因为其在超微结构和生理功能都兼有平滑肌细胞和成纤维细胞的特征，故将其命名为肌成纤维细胞（myofibroblast）。本文阐述肌成纤维细胞的形态学特征和在不同器官纤维化疾病形成中的生物学行为。

1.肌成纤维细胞的形态学特征

肌成纤维细胞在许多正常组织和病理组织中存在。在光学显微镜下，与成纤维细胞（fibroblast）具有相似的形态学特征，所以肌成纤维细胞的识别主要从超微结构和免疫组织化学染色两部分进行。

1.1 超微结构特征

肌成纤维细胞超微结构主要有3个特征：（1）应力纤维（stress fibers）：细胞膜下可见由β－/γ－actin或α－平 滑 肌 肌 动 蛋 白 （alpha－smooth muscle actin，α－SMA）组成的高度发达胞质微丝（直径5－10nm），互相平行，聚集成束状，大多与细胞长轴平行，束内散在分布电子密度高的致密体，它是最主要的收缩结构。（2）纤维连接复合体（fibronexus）：细胞内表面所形成的超成熟黏着斑（supermature focal adhesions，suFAs），直径为8－30μm，由粘着斑蛋白、桩蛋白、张力蛋白以及αvβ3、α5β1整合素构成，为肌成纤维细胞特有结构。细胞内的肌动蛋白微丝通过该复合体与细胞外的纤维连接蛋白（fibronectin）相连接，是肌成纤维细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）联系和相互作用的结构基础。（3）细胞连接：如缝隙连接等，可能与收缩冲动的传导和细胞同步收缩有关，对组织收缩具有重要作用。

1.2 免疫组织化学染色

α－SMA被认为是肌成纤维细胞特异的标志蛋白，因此α－SMA免疫组化染色是鉴定肌成纤维细胞的一个特异性方法［3］。

2.肌成纤维细胞在肺纤维化中的生物学行为

肺纤维化（pulmonary fibrosis）是由多种原因引起弥漫性肺部炎性疾病的共同结局，导致呼吸功能严重障碍，以肺泡上皮损伤、肌成纤维细胞聚集及ECM过度沉积为特征。

2.1 肌成纤维细胞的来源

目前研究发现，肺纤维化中肌成纤维细胞主要有三种来源：肺间质成纤维细胞、肺泡上皮细胞以及循环纤维细胞（circulating fibrocytes）。

2.1.1 肺间质成纤维细胞分化为肌成纤维细胞

Hashimoto等［4］通过体外实验发现，TGF－β1能够剂量依赖性地诱导人类肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。同时，TGF－β1刺激人类肺成纤维细胞c－Jun氨基末端激酶（c－Jun－NH2－terminal kinase，JNK）、p38MAPK和细胞外信号调节蛋白激酶 （extracellular signal－regulated protein kinase，ERK）发生磷酸化。但只有JNK抑制剂CEP－1347能够减弱人类肺成纤维细胞中α－SMA的表达。上述说明TGF－β1通过JNK途径调节人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。Kuang等［5］向小鼠弹性酶肺损伤后的支气管内滴注绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的肺成纤维细胞，3天后肺泡壁可见大量GFP＋肺成纤维细胞，并且表达α－SMA的表达。该实验证实了体内肺成纤维细胞可以转化为肌成纤维细胞。

2.1.2 肺泡上皮细胞分化为肌成纤维细胞

对两种肺泡上皮细胞系R3/1和L2进行传代培养，应用免疫组织化学染色和RT－PCR技术对其进行检测，发现R3/1和L2细胞不仅表达上皮细胞特异性标志物 E－cadherin、aquaporin－5和cytokeratin－8，还表达间质细胞标志物成纤维细胞特异性蛋白1和α－SMA［6］。Willis等［7］对特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的肺泡上皮细胞进行原代培养和TGF－β1（100pmol/L）长时间作用后，肺泡上皮细胞会出现成纤维样细胞的形态，并且α－SMA、Ⅰ型胶原、波形蛋白和结蛋白表达增加，上皮细胞标志物表达减少。IPF患者肺组织标本中肺泡上皮细胞共表达上皮细胞标志物和α－SMA，所以IPF中肌成纤维细胞可能来源于上皮细胞。

2.1.3 循环纤维细胞分化为肌成纤维细胞

1994年Bucala等［8］发现一类具有成纤维细胞特性的白细胞亚群，称之为循环纤维细胞。它们是骨髓来源的间充质前体细胞，约占外周血白细胞的0.1－0.5%。2001年 Abe等［9］在小鼠皮肤损伤修复模型中首次提出纤维细胞可以迁移到损伤组织处，通过转化为肌成纤维细胞，促进胶原分泌和组织纤维化。Schmidt等［10］在过敏性哮喘病人和过敏性小鼠的支气管粘膜处都发现CD34＋/procollagen I＋/α－SMA＋三阳性细胞。其中过敏性哮喘病人致敏1天后，三阳性细胞急剧增加，占CD34＋/procollagen I＋纤维细胞数量的46.9±7.8%，说明此时大约有40－50%纤维细胞转化为肌成纤维细胞；小鼠致敏8周后，三阳性细胞占纤维细胞数量的44.9±10.4%，并且定位于支气管上皮胶原沉积区。通过追踪和检验被标记纤维细胞在过敏性哮喘小鼠情况，进一步确定了纤维细胞会募集到支气管组织，并分化为肌成纤维细胞。

2.2 肌成纤维细胞的作用

2.2.1 肺泡上皮损伤

Waghray等［11］从IPF病人肺脏中分离出的成纤维细胞和小气道上皮细胞进行共培养研究，并用TGF－β1单独刺激成纤维细胞，使其表达α－SMA，而且会分泌H2O2，使在其上层的小气道上皮细胞发生死亡。

2.2.2 ECM 过度沉积

在博来霉素处理大鼠肺脏7－14天后，肌成纤维细胞表达的前胶原mRNA水平达到高峰。该细胞定位于纤维灶内，并且是肺纤维化中表达前胶原最主要的细胞类型［12］。此外，肌成纤维细胞还会表达金属 蛋 白 酶 组 织 抑 制 剂－1/2（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP－1/2）等。TIMP－1/2能够抑制胶原纤维的降解，从而造成ECM的沉积。

3.肌成纤维细胞在肝纤维化中的生物学行为

肝纤维化（hepatic fibrosis）是继发于各种肝脏慢性损伤之后组织修复过程中的代偿反应，表现为ECM过度沉积。肌成纤维细胞的大量生成被认为是肝纤维化发生与发展的关键环节。

3.1 肌成纤维细胞的来源

肝脏受到损伤后，窦状隙内的静息状态肝脏星形细胞（hepatic stellate cells，HSC）转变为活化状态HSC，它是肌成纤维细胞的主要来源。但近几年来，HSC的传统地位受到挑战，人们发现上皮细胞和骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）在一定条件下也可转化为肌成纤维细胞。

3.1.1 HSC分化为肌成纤维细胞

在正常肝组织中，内皮素－1（endothelin－1，ET－1）调节肝脏微循环和生理性胶原合成。肝脏纤维过程中，HSC合成ET－1能力增强，循环血液中ET－1水平升高，且HSC表面的ET受体增加。体外培养肝脏星形细胞发现，ET－1和sarafotoxin（ETB受体激动剂）可直接刺激HSC表达α－SMA，分化成肌成纤维细胞，而ETA/B受体拮抗剂bosentan可阻断这种作用。通过应用胃内注射四氯化碳或胆管结扎诱导SD大鼠肝硬化动物模型，体内注射bosentan也会减少HSC的活化和ECM的生成［13］。

3.1.2 上皮细胞分化为肌成纤维细胞

Xia等［14］对小鼠肝脏胆管结扎后发现，胆管上皮细胞不仅表达其特异性标志物细胞角蛋白－19（cytokeratin－19），还表达α－SMA。此外，他们对人类胆管上皮细胞进行体外培养，并用TGF－β1对其处理。结果发现，该细胞表达α－SMA和纤维连接蛋白 （fibronectin），但 抑 制 了 cytokeratin－19 的 表达。上述提示胆管上皮细胞能够转化为肌成纤维细胞。

3.1.3 BMSCs分化为肌成纤维细胞

雌性小鼠经大剂量辐射后，接受雄性小鼠骨髓移植，并且应用四氯化碳诱导其肝脏纤维化。通过RT－PCR、免疫染色和原位杂交方法追踪BMSCs，结果显示，BMSCs表达α－SMA，表明BMSCs能够分化为肌成纤维细胞［15，16］。

3.2 肌成纤维细胞的作用

多种细胞因子作用于肌成纤维细胞使其增殖、胶原合成增加而降解降低，致肝细胞功能损害，肝细胞解毒代谢作用减弱。而这些作用又进一步促进肌成纤维细胞的活化，如此循环造成大量ECM沉积，形成肝纤维化。此外，肌成纤维细胞还会大量分泌TGF－β、VEGF、TNF－α等细胞因子。肌成纤维细胞通过自分泌与旁分泌作用，促进自身增殖和HSC活化。所以即使去除致病因素，也会导致肝纤维化持续发展。

4.肌成纤维细胞在肾纤维化中的生物学行为

肾纤维化（renal fibrosis）是所有肾脏疾病进展至终末期的共同途径，以ECM过量沉积为特征，导致正常肾组织结构破坏和肾功能损害。近几年人们逐渐认识到，肌成纤维细胞与肾纤维化的发生、发展关系密切。

4.1 肌成纤维细胞的来源

对肌成纤维细胞的来源一直存在争议。目前的研究表明：可能来源于肾间质成纤维细胞、肾小管上皮细胞以及系膜细胞。

4.1.1 肾间质成纤维细胞分化为肌成纤维细胞

Tang等［17］将人类重组体血小板衍生因子－BB（platelet derived growth factor－BB，PDGF－BB）连续7天分别以0.1、1和5mg/kg剂量注入大鼠尾静脉，第3天肾脏间质成纤维细胞增殖并随之分化为肌成纤维细胞，第5天α－SMA表达达到高峰，随后开始下降，直到21天。并且PDGF－BB作用呈剂量依赖正相关，而PDGF－AA无此作用。在体外间质成纤维细胞原代培养第2天开始，α－SMA mRNA水平明显增加。但如果成纤维细胞与集合管细胞共同培养，成纤维细胞转化率会减少。减少集合管细胞的密度，则成纤维细胞转化会增强［18］。

4.1.2 肾小管上皮细胞分化为肌成纤维细胞

最近实验表明，肾小管内皮细胞会丢失上皮细胞标志物E－cadherin的表达，而表达肌成纤维细胞标志物α－SMA。体外研究小管上皮细胞系发现，TGF－β和高级糖基化终末产物参与调节上皮细胞向肌成纤维细胞转化过程［19，20］。研究肾纤维化模型证实，结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）与上皮细胞向肌成纤维细胞转化有关［21］。

4.1.3 系膜细胞分化为肌成纤维细胞

系膜细胞主要控制ECM的产生与分解平衡，维持正常的肾小球结构。但在病理情况下，肾小球中的系膜细胞可表型转换为肌成纤维细胞。Johnson等［22］研究证实，在大鼠系膜增生性肾小球肾炎第3天系膜细胞开始增殖，伴有α－SMA蛋白和mRNA表达增加，一直持续到14天。当通过去除补体或去除血小板能够阻止或减少系膜细胞增殖，并且α－SMA表达也被抑制。王玉等［23］和林小红等［24］对人类系膜增生性肾小球肾炎病变标本做免疫组织化学染色，检测到随着系膜细胞增殖程度的加重，α－SMA的表达程度也增加，α－SMA阳性表达作为系膜细胞受损激活和表型转化的标志，可反映系膜细胞的机能状态和增殖情况。

4.2 肌成纤维细胞的作用

肾纤维化中，来自肾间质成纤维细胞、肾小管上皮细胞及系膜细胞等转化而来的肌成纤维细胞会产生大量ECM，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、糖蛋白及蛋白聚糖，并分泌TIMP，使ECM在肾间质中产生增多和分解减少，造成ECM大量沉积，从而导致肾间质纤维化。Zhang等［25］在肾中毒血清肾炎大鼠模型中发现，肾小球和肾间质α－SMA表达程度与ECM成分的表达量呈正相关，并且在该肾炎早期阶段，肾小球α－SMA免疫染色结果可以很好地预测该肾炎进一步进展为肾小球硬化症和肾功能不全；间质α－SMA免疫染色结果则是该肾炎发生间质瘢痕和肾功能损害有价值的预测指标。此外，研究表明，糖尿病大鼠肾组织α－SMA表达增高和Ⅳ型胶原表达增强，同时两者表达呈正相关，提示肾脏ECM过度聚集在糖尿病早期就已开始，肌成纤维细胞在此过程的启动和进展中起重要作用［26］。

5.展望

对于肌成纤维细胞的研究已有近四十年，但有关肌成纤维细胞在肺、肝及肾纤维化中活化、增殖的调控机制及其作用研究仍然方兴未艾。随着研究的深入，将会进一步阐明调控肌成纤维细胞生物学行为的分子机制，有助于寻找干预治疗的关键性环节，为延缓或逆转纤维收缩性疾病提供理论基础。

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