TNF-α与骨骼肌损伤和修复

屈芳 左群

上海体育学院运动科学学院（上海200438）

肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）是一种能使肿瘤发生坏死的物质，主要由内毒素激活单核/巨噬细胞产生，是启动抗菌炎症反应的关键细胞因子［1］。长期以来，动物及人体实验均发现，慢性感染、肌萎缩、恶病质和杜氏肌营养不良等消耗性疾病以及正常的衰老进程中，血液TNF-α水平和/或骨骼肌TNF-α表达增多并伴随骨骼肌丢失［2-4］，因此，传统观点认为TNF-α是一个负性调节因子，但近年来有研究发现，肿瘤坏死因子中的TNF-α能通过p38MAPK和NF-κB信号途径影响肌肉再生过程，对骨骼肌的损伤和修复可能起到重要的调节作用。

1 TNF-α概述

TNF是1975年发现的一种能使肿瘤发生出血、坏死的细胞因子，分为TNF-α和TNF-β两种，其中TNF-α又分为跨膜型TNF（membrane-expressed form of tumor necrosis factor-α，mTNF-α） 和分泌型TNF（secretory tumor necrosis factor-α，sTNF-α）。mTNF存在于细胞膜表面，分子量为26 kD，是一种完整的跨膜前体蛋白，为sTNF的前体［5］。 sTNF是mTNF在肿瘤坏 死 因 子 α 转 化 酶 （Tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE）的作用下裂解后释放的一个亚基，分子量为17 kD［6］。 mTNF-α主要通过细胞和细胞之间的接触，在局部发挥作用，sTNF-α可进入血循环作用于远距离的组织或器官［7］。TNF通过与受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）结合产生生物学效应。 TNFR分为1型TNFR（TNFR1，P55）和2型TNFR（TNFR2，P75）。 根据存在形式的不同，TNFR分为细胞膜性TNFR（mTNFR）和存在于血液等体液中的可溶性TNFR（sTNFR）。TNFR1在细胞损伤、细胞程序性死亡、激活核转录因子（NF-κB）等多种生物信号的传递方面起着重要作用，TNFR2主要传递胸腺细胞和NK细胞的增殖信号。有研究发现，mTNF1既可与各种细胞的TNFR2结合，亦能与TNFR1结合，而sTNF-α仅能与TNFR1结合，所以mTNF-α具有更强的细胞毒性作用［5］。大量的研究已经证实TNF-α的活性大多由TNFR1介导，提示TNF-α主要是以sTNF-α的形式发挥各种生物学活性。在活化的巨噬细胞内TNF-α以膜结合型存在并多以旁分泌或自分泌形式释放。TNF-α的来源广泛，除了单核细胞，T细胞、B细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等都可以产生TNF-α，目前有研究表明，骨骼肌细胞同样可以分泌TNF-α［8-10］。

TNF-α的生物学活性广泛而且复杂，可参与免疫应答、介导炎症反应、抗肿瘤、抗病毒等，并参与内毒素休克和恶液质等病理过程的发生和发展，在调节适应性免疫、杀伤靶细胞和诱导细胞凋亡等过程中发挥重要作用。作为炎性反应的调节者，TNF-α通过刺激血管内皮细胞表达粘附因子，刺激单核吞噬细胞和其他细胞分泌趋化性因子，提高白细胞的粘附和游走能力，引起白细胞在炎症部位聚集。同时TNF-α可增强中性粒细胞吞噬杀伤能力，刺激细胞脱颗粒，促进超氧阴离子及髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）的产生［11，12］。 TNF-α介导组织的炎症性损伤既可以依赖中性粒细胞（polymorphonuelearleueoeyte，PMN）［13］， 也可以不依赖PMN发挥作用［14］。

2 骨骼肌损伤与TNF-α的变化

对于TNF-α在骨骼肌损伤和修复过程中的作用，首先是从骨骼肌损伤后血清中TNF-α含量和TNF-αmRNA表达的变化开始认识的。许多研究发现骨骼肌损伤后血液中的细胞因子如IL-1、IL-6、IFN-γ和TNF-α等的含量会发生变化［15-20］。 这些促炎症因子的拮抗剂如IL-1ra、IL-10、TNFR等的血液水平也有显著变化［19］。有研究发现并认为［15］，运动尤其是离心运动后血浆和尿液中IL-1、IL-6以及TNF-α含量的升高，是由于运动过程中肌肉损伤所致，肌肉损伤是触发运动过程中细胞因子反应增加的一个主要因素。但最先报道有关急性运动诱导骨骼肌TNF-α在转录水平表达的是2003年Nieman等的研究［20］，他们发现马拉松运动员（25~60岁，男性和女性）在3 h 70%最大摄氧量跑台运动后活检股外侧肌TNF-α mRNA表达量和运动前相比显著增加。动物研究也有类似的结果，SD大鼠在进行一次1 h离心运动和一次2 h离心运动后即刻出现骨骼肌TNF-αmRNA和TNF-α蛋白的表达，并且在2 h急性离心运动后的24 h内，TNF-αmRNA表达逐渐增加，且TNF-α蛋白的表达有大幅度增高。血清TNF-α水平在1 h离心运动后即刻和对照组相比有增高，但无显著性差异；而2 h最大离心运动后即刻至24 h以内血清TNF-α水平逐渐增高［16］。然而，人体研究中也有不同报道。如健康男青年以55%做功负荷（maximal workload，Wmax）进行180 min的膝关节屈伸运动，在运动的30 min、90 min和180min时测试血浆TNF-α的含量和股外侧肌中TNF-αmRNA的表达，结果发现在整个运动过程中，血浆TNF-α含量没有变化，肌肉组织中TNF-α mRNA的表达也没有差异［21］。上述研究结果的不同，笔者分析可能与后者只是局部肌肉运动，不是全身运动有关。在慢性炎症肌病如肌萎缩、肌营养不良症中发现，病人血浆和肌内TNF-α的含量和正常人相比都有显著性差异，其中杜氏营养不良的病人血浆TNF-α含量较正常人高出近10倍［2］，肌肉活检取材也观察到TNF-α的表达量显著增加［3］，这表明炎性肌病中TNF-α的高表达参与了骨骼肌的降解，引起肌肉的恶性消耗。因此，骨骼肌损伤后TNF-α含量的变化表明TNF-α可能与损伤后的炎症反应有关。但上述研究结果尚不能具体说明TNF-α究竟对骨骼肌损伤和修复起到何种作用。

传统观点认为，单核细胞是产生TNF-α的主要来源。但研究发现，骨骼肌损伤后血液中TNF-α的变化与单核细胞的变化无论在数量上，还是在单核细胞中TNF-αmRNA表达方面均表现出不一致［22］。运动引起血浆TNF-α升高的同时，并没有伴随血液中单核细胞的数量发生变化，该研究认为运动训练中氧化应激是引起TNF-α、IL-6和IL-1b等细胞因子产生的重要因素，并非炎症反应［22］。这提示运动过程中血液TNF-α含量升高并非由单核细胞产生，可能由其他组织产生。Li等［10］第一次检测到C2C12细胞可以自分泌TNF-α，可以调节肌细胞的生肌活性，并认为TNF-α可能成为一种新的肌源性调节因子。TNF-α在骨骼肌损伤和修复中的作用得到了新的认识，TNF-α在肌生成和肌肉再生过程中的作用引起了研究者的广泛兴趣。

3 TNF-α与骨骼肌损伤和修复

3.1 TNF-α与成肌调节因子MyoD

骨骼肌损伤后的再生修复是其损伤病理过程的一部分，通过肌组织同种特异性细胞的再生重建其原有的正常结构与功能［23-25］。骨骼肌损伤和修复包括骨骼肌的变性坏死和肌纤维结构破坏→炎性细胞浸润（吞噬坏死细胞成分）→卫星细胞的激活、增殖和分化→肌管形成、融合→新的肌纤维形成和成熟→肌肉功能恢复等一系列过程。骨骼肌损伤后，静息态的卫星细胞被激活，进而增殖、分化，最后这些细胞融合到现有的肌纤维或融合形成新的肌纤维，对骨骼肌再生起到重要作用［23，26，27］。 MyoD是成肌调节因子MRFs家族的成员之一，是成肌的决定因子［28］。静止期的卫星细胞不表达任何MRFs，也无MRFs的mRNA表达。在新生和再生肌肉中卫星细胞含有高水平的MyoD蛋白，待卫星细胞融合成肌管后，MyoD免疫活性快速消失，实验发现肌肉损伤后被激活的卫星细胞首先表达MyoD［29］。MyoD不仅可促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化，而且能使多种类型细胞（如成纤维细胞、脂肪细胞等）转化为成肌细胞，并促进成肌细胞进一步融合、分化为成熟的肌纤维。在炎性肌病如肌萎缩、恶病质等的研究中发现TNF-α通过激活NF-κB抑制MyoDmRNA的表达，在成肌过程中起到抑制作用［4，30］。 Guttridge［4］等报道TNF-α与IFN-γ活化NF-κB（nuclear factor-κB）后在转录后水平下调MyoD蛋白表达，随即引起肌纤维合成减少，表明TNF-α/NF-κB可以通过抑制MyoD表达介导骨骼肌萎缩。但是在急性骨骼肌损伤的研究中却发现TNF-α可以上调MyoD的表达，对TNF-α受体双敲除以及中和TNF-α抗体的小鼠进行冻伤后，发现野生型小鼠胫股前肌TNF-αmRNA和蛋白表达都增加，在损伤后13天恢复到正常水平；而在TNF-α受体双敲除小鼠骨骼肌中MyoDmRNA的表达减少，且肌力下降。表明冻伤后的肌肉修复过程中，TNF-α可能通过MyoD的表达发挥调节作用［31］。由此可见，TNF-α在慢性和急性骨骼肌损伤后均能通过作用于MyoD的表达来调节成肌分化。由于炎性肌病病人体内TNF-α含量长期高表达，且比急性损伤后机体产生的TNF-α的含量要高得多，笔者推测不同TNF-α浓度的差异导致对MyoD的作用不同。

3.2 TNF-α与NF-κB

NF-κB是一种具有转录功能的蛋白质。作为能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子结合的核因子，起初NF-κB被认为仅在B淋巴细胞中表达［32］，后来人们发现NF-κB几乎在所有类型细胞中都表达，能够激活细胞周期蛋白Dl和c-myc（促进细胞从G1期进入到S期）的表达，具有调节免疫和炎症反应以及促进细胞增殖和凋亡的作用。研究发现，肌萎缩与TNF-α介导的NF-κB通路的激活有关［33］。在慢性炎性肌病研究中发现，TNF-α通过NF-κB依赖的信号途径抑制肌分化［33，34］；体外培养实验中用TNF-α或者IL-1b处理过的原代肌细胞会因为NF-κB的激活而使MyHCf的表达下降，但是在加入抑制因子IκB后又可以使肌分化恢复正常，相反IκB激酶的过表达使NF-κB激活也足以阻断肌分化，提示TNF-α是通过激活NF-κB进而抑制肌分化的。但是TNF-α这种抑制作用是可逆转的，因为在C2C12成肌细胞的培养基中加入TNF-α后，CK活性和myogenin的表达都显著下降，提示TNF-α抑制了肌分化；但是用新鲜的DM培养基取代加入TNF-α的培养基后肌分化迅速恢复，表明TNF-α并不具有特异性的细胞毒性，不会影响肌肉特异性蛋白的显著性缺失［33］。研究还发现已经分化的肌细胞不再因NF-κB的激活而受到影响［33］，表明在肌分化过程中TNF-α的作用具有时间依赖性。在和年龄相关的系统炎性疾病如肌萎缩等的研究中也发现TNF-α的作用和年龄相关，与年轻个体相比，TNF-α对年老个体的肌再生能力影响较大，且年老者机体内肌肉蛋白质降解也和机体内长期高水平的TNF-α有关［35］。对大鼠成肌细胞和骨骼肌卫星细胞DNA合成的研究发现，TNF-α可以通过同一种方式刺激血清应答因子和血清效应因子，激活肌卫星细胞进入细胞周期并加速其从G1期到S期的转换［8］。对C2C12成肌细胞给予血清限制后，TNF-α的表达增加，进而激活NF-κB和血清效应因子SRF（成肌细胞分化所必需的转录因子），被激活了的NF-κB和SRF可以刺激MHC和骨骼肌α-actin的表达，进而促进肌细胞的早期分化；而中和TNF-α抗体能够抑制NF-κB的活性，提示TNF-α作为一个自分泌因子通过刺激NF-κB和血清效应因子的活性来促进骨骼肌的早期分化［8］。同样在成肌细胞的培养中发现，增加外源性的TNF-α能促进其增殖，抑制肌细胞的融合，提示TNF-α对肌细胞从早期分化向终末分化的转换过程起到了抑制作用［30］。

3.3 TNF-α与p38

p38在细胞生长发育中有重要作用，酵母和哺乳类动物研究均发现p38对细胞生长的作用［36］。有研究显示，p38参与了血管发生、红细胞发生、骨骼肌发生、心肌发生等过程［37］，以及细胞分裂的Gl和G2M阶段［38］。由于p38MAPK的活化对于染色体重塑和生肌转录因子的活化都至关重要，因此p38MAPK通路被认为是肌生成的开关［9］。研究发现，TNF-α在骨骼肌损伤修复中发挥调节作用是通过激活p38MAPK信号途径来实现的［9］。对TNF-α受体双敲除小鼠通过心脏毒素导致比目鱼肌损伤后，在TNF-α受体缺失的情况下，p38的活化受到抑制，且肌分化的标志性分子MEF2C、Myogenin和p21等蛋白的表达也受到抑制，提示肌分化减弱。但当利用MKK6激活p38的表达后可使TNF-α受体缺失小鼠的肌再生过程恢复正常。研究结果充分表明TNF-α通过活化p38的途径调节肌再生。

值得注意的是，一些研究发现TNF-α在肌肉修复 过 程 中 的 作 用 和 浓 度 有 关［9，33，35，39，40］。 TNF-α为0.05 ng/ml时足以刺激肌生成，但当浓度在0.5到5 ng/ml范围时抑制肌形成，表明生理浓度范围的TNF-α可以刺激肌生成，而病理浓度范围则抑制肌生成［9］。这提示肌肉损伤后TNF-α浓度的瞬间升高有利于刺激肌形成，但TNF-α的持续升高对肌肉修复具有负效应。体内循环中高TNF-α水平被认为是一个重要的病理性因素，导致肌肉的恶性消耗、炎性反应、胰岛素抵抗等。对于像肌肉萎缩、肌营养不良等慢性炎症肌病，长期高水平的TNF-α可能会刺激骨骼肌卫星细胞持续分化，导致大量消耗肌卫星细胞，不利于骨骼肌的再生修复。尽管在肌形成的早期阶段TNF-α对于p38的激活非常重要，但是对于后期p38的磷酸化TNF-α起到抑制作用，同时抑制了MHC的表达，进而抑制了肌形成［9］。这提示我们TNF-α在骨骼肌损伤修复中发挥作用不仅具有时间依赖性，同时具有剂量依赖性。但是目前的研究中有关TNF-α平衡肌肉蛋白合成与降解的阈值究竟是多少还不是很清楚。同时研究发现［33］，TNF-α抑制肌再生的表现是阻止成肌细胞分化为肌管以及成肌细胞特异性骨骼肌基因的表达；但当成肌细胞已经融合分化为肌管时，TNF-α对骨骼肌的基因表达不起作用，表明TNF-α的信号通路在成肌细胞分化之前，提示TNF-α的作用对象可能是卫星细胞。

目前有关TNF-α在骨骼肌损伤修复中作用的研究主要集中在早期分化之前的阶段。虽然有体外研究发现TNF-α可以促进肌管细胞中蛋白质的合成和提高蛋白酶活性［39，40］，表现为对大鼠L6肌管细胞进行TNF-α处理24 h后， 当TNF-α浓度为10U/ml时，MyHCf的表达量显著增加［39］。 在对C2C12细胞用10 ng/m l浓度的TNF-α进行处理24 h后，用放射性标记的苯丙氨酸检测总蛋白含量和细胞脱氢酶（dehydrogenase activity，DHA）的活性，发现二者都显著增加，上述结果在新生鼠肌细胞原代培养实验中也得到了证实，而且结果还显示TNF-α的作用主要是通过PI3K-Akt-GSK-3，PI3K-Akt-4E-BP1和MAP-ERK-eIF4E途径实现的［40］。由于缺乏更多的从终末分化之后到形成具有功能性的肌纤维这一过程的研究，TNF-α在骨骼肌损伤和修复后期是否发挥作用以及作用通路如何，还需在进一步系统研究的基础上加以认识。

4 小结

研究已经发现TNF-α主要通过p38MAPK、NF-κB等途径对生肌过程发挥调节作用，表现为促进增殖和早期分化。但是否还存在其他的作用途径以及在骨骼肌损伤和修复的后期是否发挥作用还需要探讨。TNF-α的组织来源广泛，不同细胞分泌的TNF-α对骨骼肌损伤和修复的作用是否存在差异以及运动性骨骼肌损伤和修复过程中TNF-α的作用如何都需要深入研究。

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