LAMP技术在猪传染病检测中的应用

李春燕，汤德元*，张晓杰，曾智勇，罗险峰，甘振磊

（1.贵州大学动物科学学院 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008）

随着现代分子生物学的迅速发展，新的核酸扩增技术不断出现。70 年代初，核酸内切酶的发现使人们能够通过分子克隆的方法分离并克隆基因。传统的分子克隆技术包括酶切、连接、转化、培 养以及同位素标记、探针的筛选等过程，大约要用1～2 周时间才能完成。80 年代中期，人们建立了聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)，将DNA 扩增过程缩短到了2 h～3 h，使得分子克隆技术得到了突破性的改进。然而该技术的特点是温度梯度的循环变化，因此需要特殊的实验设备。目前，核酸扩增技术的一大研究热点是恒温反应，即在恒温条件下实现对靶标序列的大量扩增，从而不需要特殊的实验设备。而当前恒温扩增技术主要包括链置换扩增法(strand displacement amplification，SDA)、核酸序列扩增法(nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)、转录介导扩增法(Transcription Mediated Amplification，TMA) 和滚环扩增法(Rolling Circle Amplification，RCA)等。其中环介导等温扩增法(LAMP)是由Notomi 等于2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法。其特点是针对靶序列的6 个特异性区域设计2 对引物，利用一种具有链置换活性的DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下(65 ℃左右)放置30～60 min，即可实现核酸的大量扩增，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸酶沉淀产生。LAMP 技术以其特异性强、灵敏度高、快速准确和操作简单等优点，在核酸的科学研究、疾病的诊断和预防、动物胚胎的性别鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。本文主要综述了LAMP 技术在猪传染病检测中的作用，为该技术的深入研究和应用提供参考。

1 LAMP技术的原理

等温扩增反应(LAMP)是对靶基因的6 个特异部位设定2 对引物，利用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增，其反应体系还包括模板DNA、dNTP 和缓冲液。其基本操作过程是将LAMP 反应体系(除Bst DNA聚合酶)在95℃加热5min 后，冷却，再加入8U Bst DNA 聚合酶，在63℃保温60 min，然后在高于80 ℃的温度下加温2 min 终止反应。

等温扩增反应4 条引物中2 条为内引物，2 条为外引物。内引物FIP(forward inner primer) 包含F1c序列和F2(F2c 区域的互补序列)，即5′-F1c-F2；内引物BIP(backward inner primer)包含B1c(B1 区域的互补序列) 和B2 序列，即5′ -B1c-B2。外引物为F3 和B3 序列。靶序列上的6个特异区域：F2c 和B2，F1c 和B1（分别位于F2c 和B2 内侧），F3c 和B3（分别位于F2c 和B2 外侧），序列长度约为17nt～24nt 的[1]。

在LAMP 循环扩增阶段，这种哑铃结构的DNA 为循环反应提供了原料，哑铃结构的DNA 通过自我引导延伸，生成双链茎环结构，循环反应中引物FIP 结合到茎环DNA 的环状结构上，引导合成新的DNA 双链，同时置换出与之相同序列的链，形成一个过渡性茎环结构DNA，在其茎上含有一个靶序列反向拷贝，而另一端通过BIP 形成一个环状结构，在随后自我引导的链置换DNA 合成反应中生成一条填补好缺口、长度为靶DNA 2 倍的茎环DNA 和一个与结构6 互补的DNA 链。这样就在结构6 和结构12 之间建立了循环反应。结构8 和结构14 可为伸长和再循环阶段中由内引物引导的链置换反应提供模板。在伸长和再循环阶段，内引物引导链置换延伸反应，茎环个数逐渐增加，最后的扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA 片段混合物。

LAMP 扩增产物检测一般包括以下3 种方式：（1）SYBR Green I 检测，在反应液中加入SYBR Green I，可在紫外灯或日光下通过肉眼进行扩增结果判定。如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I 的橙色不变；（2）副产物-焦磷酸镁的浊度检测，这种检测方式具有极高的特异性，使用浊度仪甚至肉眼观察就能够判断扩增与否；（3）琼脂糖电泳检测，因LAMP 产物均为初始结构的整数倍，扩增产物经琼脂糖电泳后形成特异的梯状条带。

2 LAMP技术方法上的延伸

Nagamine[2]通 过 在F1c-F2c/B1c-B2c 之间创新性地设计一对环引物Loop F/Loop B，大大缩短了LAMP反应的时间，整个扩增反应在0.5h 即能完成。环引物通过结合在茎环结构的环状区域互补序列上，大大加速了整个链置换反应过程，从而提高了反应效率。Nagamine[3]建立了一种分离LAMP 反应产物单链DNA 的方法使LAMP 技术能够应用于微阵列分析，并证明通过在内引物上设计TspRI 限制性酶切位点可以使这种方法得到推广。Maruyama[4]建立了insitu LAMP 检测方法对携带stx2 基因的细菌进行了原位检测，由于其温和的穿透条件及较低的温度要求，相比原位PCR，其对细胞的伤害要小得多，对细胞结构的破坏较小。Fukuta 建立了RT-LAMP 方法并成功将其用于番茄斑萎病毒的检测，使LAMP 技术的应用拓展到RNA 病毒检测。Hong 等建立了SARS 的一步法单管RT-LAMP 检测方法，大大简化了LAMP 技术用于RNA 病毒检测的操作步骤。Aoi 建立了胺氧化细菌的Real-time quantitative LAMP 检测方法，使LAMP 技术能够应用于核酸的定量测定。

3 LAMP技术在猪传染病检测上的应用

LAMP 和RT-LAMP 技 术 以 其 特异性强、灵敏度高、速度快和操作简单等特点而倍受人们青睐。在猪病方面主要用于细菌疫病、病毒疫病和某些寄生虫的DNA 或RNA 的检测，已在猪传染病的检测中起到了一定的作用，现分述如下：

3.1 LAMP 技术用于细菌的检测

3.1.1 用于大肠杆菌的检测

大 肠 杆 菌（Escherichia coli，E.coli）可以引起仔猪白痢、仔猪黄痢和猪水肿病。传统细菌分离费时费力并且一些快速检测方法容易与其他型大肠杆菌混淆产生假阳性。Maruyama等2003 年首次采用LAMP 方法快速检 测E.Coli Ol57:H7O27( 有 一 个stxl 基因和两个stx2 基因)的stx2 基因，并用FITC 标记抗E.Coli O157:H7 抗体，在紫外下照射。试验结果显示，较原位PCR 而言，温和的渗透性及低等温条件使得原位LAMP 引起较少的细胞损伤，并且在DNA 扩增中允许使用荧光抗体标记。Yano 等用LAMP 技术对肠毒素大肠杆菌的LTI 及STI 基因进行研究，实验结果再次证明了LAMP 的特异性(非LTI 及STI 基因型的Ecoli及其他细菌均不扩增)及高灵敏性和高效性，加入环引物后扩增时间可以从60min 缩至35min。

3.1.2 用于沙门氏菌的检测

《规划》对河道背水侧管理范围内的护堤地用材林进行空白段新造林和疏林地、成熟林、过熟林地的更新改造，选择速生、材质好、耐粗放管理和耐病虫害的乡土树种。新造林采用生长较快的杨树、泡桐等树种；更新改造采用榉树、楸树造林；采取株行距4 m×5 m的块状混交方式。在河道背水侧护堤地栽植用材林，不仅可以有效增加林木原料储备，为防汛提供抢险木材，而且可以形成以堤防为轴线的防风林带，与临水侧的防浪林互配互衬，成为林水结合的绿色长廊。

沙门氏菌病是由沙门氏菌（Salmonella）引起的一种人、畜共患的传染病。猪霍乱沙门氏菌是引起仔猪副伤寒的主要病原菌，给养猪业造成重大危害。Hara-Kudoa 等对沙门氏菌的39 个血清型220 个菌株进行了LAMP检测，灵敏度达到2.2 CFU/管，明显高于常规PCR。朱胜梅[5]等以沙门氏菌为研究对象，根据其特异性的invA基因，设计了一套特异性引物对该基因进行了LAMP，同时优化了其反应条件，在此条件下，LAMP 检测沙门菌DNA的敏感度达10 fg/反应，且与其他常见的细菌无交叉反应。

3.1.3 用于副猪嗜血杆菌的检测

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，H P)为革兰氏阴性短小杆菌，形态多变，该菌生长需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD 或V 因子)，一般条件下难以分离和培养。朱杰仪[6]等根据GenBank 上发表的不同血清型Hps 的16S rRNA 序列，找出其高度保守区域，再针对该区域设计了4 条特异性引物，建立了Hps 环介导等温扩增法。试验结果表明，LAMP 方法在恒温(63℃)条件下特异性强，比PCR 方法敏感100 倍。鉴于目前副猪嗜血杆菌分离培养和鉴定的复杂性，LAMP 方法操作简单、成本低，整个扩增反应在1h 内即可完成，为检测Hps 提供了一个快速简便的分子生物学方法。

3.1.4 用于猪胸膜肺炎放线杆菌的检测

猪传染性胸膜肺炎又称为猪胸膜肺炎放线杆菌病，是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus P1europneumoniae，APP)所引起的一种危害猪呼吸道的疾病，以胸膜炎和肺炎症状及病变为特征。李佳禾等[7]以I 型猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV 基因片段为靶序列设计了一组引物，建立了敏感、特异的猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。在63 ℃等温条件下反应45 min，最低可检测到102个拷贝的目的基因，敏感性是PCR 方法的10 倍。通过对8 头猪胸膜肺炎放线杆菌实验感染猪和127 份临床发病猪的鼻拭子进行检测，发现该方法对鼻拭子中猪胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%，明显优于PCR 方法。

3.2 LAMP 技术用于猪病毒的检测

3.2.1 用于日本脑炎病毒的检测

流行性乙型脑炎简称乙脑，是由黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种严重威胁人畜健康的急性中枢神经系统传染病，是重要的人畜共患病及虫媒病毒病。Toriniwa 等[8]利用LAMP 原理建立了一个快速且能定 量 的Real-time RT-LAMP 方 法，通过扩增JEV 的包膜(E)蛋白基因来定量检测JEV，将检测时间缩短至1h，检测下限为1PFU，其敏感性与常规RT-PCR 相似；同时作者利用所建立的RT-LAMP 法对与JEV 同家族的森林脑炎病毒和相关病毒(登革热病毒和西尼罗河病毒)进行了扩增，均未检测出，结果显示了所建立的RT-LAMP法对JEV 检测的高度特异性；另外，作者把通过RT-LAMP 检测出的病毒数量与用常规病毒定量方法检测出的数量比较显示两个结果高度相符，作者认为RT-LAMP 是一种快速的定量检测JEV 的方法。由于其不需特殊的仪器设备，有利于其在经济不发达地区的运用。

3.2.2 用于口蹄疫病毒的检测

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫病毒属于小RNA 病毒科，口蹄疫病毒属，该病毒有7 个血清型，各型之间无交叉保护反应。吴绍强等[9]以灭活的亚洲Ⅰ型口蹄疫细胞培养病毒为材料，通过在病毒基因组的3D 区域设计3 对引物，建立口蹄疫病毒的RT-LAMP 检测方法，对反应体系中的成分以及反应条件（反应温度）分别进行优化，并进行敏感性和特异性确定。建立了亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的RT-LAMP 检测方法，为口蹄疫的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法，可以满足现场检疫的需要。

3.2.3 用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV) 属 于 单 股正链RNA 病毒，该病毒可引起的一种猪急性高致死性传染病。赵彦宗等[10]根据GenBank 中登录的PRRSV M 基因保守序列6 个特异性部位设计了2 对引物，建立了PRRSV 的环介导逆转录等温检测方法。结果表明，该方法灵敏度比RT-PCR 高100 倍；全部反应可在1h 内完成并可得到其特有的阶梯状条带，而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性；在反应体系中添加SYBR GREEN Ⅰ染料后，可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果。该方法灵敏度高、特异性好，可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法。

3.2.4 用于猪瘟病毒的检测

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起猪的高度传染性致死性病毒性疫病。刘中勇等[11]设计了4 条针对猪瘟病毒6 个位点的特异性引物，建立了一种灵敏、特异、快速的猪瘟病毒体外等温扩增(RT-LAMP)检测方法，所建立的方法能够特异地检测出猪瘟病毒的存在，检测PRV、PRRSV、PCV2 等病毒均为阴性；灵敏度高，所建立的CSFVRT-LAMP 方 法 灵 敏 度 为10-5， 总RNA 的检测阈值约为1pg；反应快速，整个扩增反应可在1h 内完成；操作简单，不需要PCR 仪等复杂的仪器，结果可经肉眼观察及电泳检测。本试验为猪瘟的现场快速检测提供更加简便、快速的方法，可以满足基层检疫的需要。

3.2.5 用于非洲猪瘟病毒的检测

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的急性、接触性传染病，主要特征是高热、皮肤发绀以及淋巴结和内脏器官的严重出血，死亡率可高达100%。江彦增等[12]利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行，不需要其他昂贵仪器，30 min 即可得到阳性结果，灵敏度是OIE 标准PCR 方法的100 倍，并且与其他常见猪DNA 病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。

3.2.6 用于猪细小病毒的检测

猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)属细小病毒科细小病毒属，为无囊膜的单股线状DNA 病毒，是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。刘业兵等[13]根据GenBank 公布的PPV序列，在其保守序列区域设计了多套LAMP 引物，利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320 仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件，建立了对PPV 病毒DNA 进行特异扩增的LAMP 检测方法，并可通过加入SYBR Green I 肉眼判断结果。该方法在63℃恒温下作用45min，PPV 病毒DNA 获得了高效率的特异性扩增；其检出限量为0.23 TCID50，敏感性高；在反应结束后加入SYBR Green I 肉眼判断结果，与Real Time Turbidimeter LA-320 仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP 检测与免疫荧光鉴定、PCR 方法比对，符合率均为20/20。从而建立了一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒（PPV）环介导等温扩增（LAMP）方法，为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。

3.2.7 用于猪圆环病毒2 型的检测

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科圆环病毒属成员，是已知最小的动物病毒之一。根据抗原性及基因组组成，PCV分成两个血清型，即PCV1 和PCV2，而PCV1 无 致 病性。杨得胜[14]以猪圆环病毒2 型为材料，设计了3 对引物，构建了猪圆环病毒2型环介导等温扩增（LAMP）检测方法，并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环病毒2 型的LAMP 检测方法，可以采用琼脂糖凝胶电泳、颜色变化、生成的沉淀等现象判定反应结果，为猪圆环病毒2 型的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法，可以满足现场检疫的需要。

3.3 LAMP 技术用于猪寄生虫的检测

LAMP 技术用于猪寄生虫方面，目前主要用于猪附红细胞体的检测。猪附红细胞体病是由猪附红细胞体寄生于猪红细胞表面或游离在血浆中引起的一种以贫血、黄疸、发热等为主要临床特征的人畜共患病（猪附红细胞体属寄生虫，也有人认为是立克次氏体目，目前尚未形成共识）。李月梅等[15]利用LAMP技术成功检测到猪附红细胞体基因区，并用10 倍系列稀释的DNA 样品对该检测方法的灵敏度进行了测试，此方法的灵敏度可达到5×105倍稀释的DNA 分子水平，并且特异性强，对新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫病原体检测均为阴性。

当前，LAMP 技术已经得到了广泛的应用，并且已开发出用于LAMP引物设计的相关软件， 如Primer Explorer version 3 软件，使引物设计更加简便。但LAMP 技术本身仍存在一些未阐明的问题，例如Nagamine[16]曾报道DNA 模板在不预变性的条件下也能发生LAMP 扩增，但其机制尚不清楚，如果这种现象的原因得以阐明，将进一步简化LAMP 技术的操作程序。综上所述，LAMP 技术是一种便捷、特异而又灵敏的快速基因检测技术，与PCR 和Real-time PCR 相比不需要特殊的仪器设备，如果对其进一步优化、完善，该技术必将在食品安全、疾病诊断及基因芯片等领域发挥重要的作用。

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