鸡枞菌多糖抗环磷酰胺对小鼠免疫器官损伤的作用

王思芦

（西昌学院动物科学学院，四川西昌615013）

脾脏和胸腺是小鼠重要的免疫器官，也是外周淋巴细胞分化与成熟的地方，其组织结构的变化必将影响免疫细胞的成熟和功能。据报道，一些免疫抑制剂如环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、氢化可的松、地塞米松等药物可导致免疫器官发生萎缩，使小鼠免疫器官指数降低，外周血中淋巴细胞数量减少，从而使小鼠细胞免疫功能受到严重的抑制［1-3］。鸡枞菌是一种珍稀食用及药用真菌，据报道其提取物具有抗高血脂［4］，抗氧化［5］，促进淋巴细胞增殖等作用［6］，对小鼠体液及细胞免疫功能均有一定的促进作用。本试验主要探讨了鸡枞菌多糖（TAP）对CTX引起脾脏及胸腺器质性损伤的拮抗作用，从免疫器官重量和组织结构的变化分析TAP对小鼠免疫功能的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 鸡枞菌多糖由动物疫病与人类健康四川省重点实验室制备，多糖纯度为92.17%；环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号20100509）；甲醛，乙醇，二甲苯，伊红，苏木精，石蜡等。

1.1.2 实验动物 50只健康昆明小鼠，体重20g～22g，雌雄各半，购自四川省医学科学院实验动物研究所。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 将50只小鼠随机分为空白组、模型组及TAP高、中、低剂量组，每组10只。空白组和模型组每天腹腔注射生理盐水0.2mL，TAP高、中、低剂量组分别每天腹腔注射TAP 200、100、50mg／kg，连续7d；给药后第5天，除空白组外，其余各组每天腹腔注射环磷酰胺（CTX）100 mg／kg，连续3d，于第8天处死。

1.2.2 小鼠脾脏及胸腺指数测定 处死小鼠后，将其脾脏和胸腺周围组织剥离干净后分别称重，按以下公式［7］计算免疫器官指数：

1.2.3 小鼠脾脏和胸腺组织切片制作 将各组小鼠的脾脏和胸腺浸泡于40mL／L甲醛溶液固定24 h，流水浸洗30min，经过750、850、950、1 000mL／L乙醇依次脱水6h，甲苯处理3h，石蜡液浸泡40min后包埋、切片；将切片以苏木素染色10min，水洗后以10mL／L盐酸酒精处理40s，水洗，5mL／L氨水处理5s，伊红染色10min，再由750、850、950、1 000 mL／L乙醇依次脱色，经过甲苯透明15min后以树脂封片镜检［8］。记录各组脾脏和胸腺组织结构的变化特点。

1.2.4 数据处理 采用SPSS13.0分析软件进行数据统计，用Duncan法进行多重比较分析组间差异。

2 结果

2.1 TAP拮抗CTX对小鼠免疫器官指数的影响

与空白组比较，模型组的脾脏和胸腺指数显著降低（P＜0.01）；而与模型组相比，50mg／kg～200 mg／kg TAP均能极显著提高免疫抑制小鼠的脾脏指数（P＜0.01）及胸腺指数（P＜0.01），且以高剂量TAP效果最佳，可使脾脏指数和胸腺指数分别比模型组提高113.3%和101.1%（表1）。

表1 TAP拮抗CTX对小鼠免疫器官指数的影响Table 1 The antagonism of TAP to CTX on immune organ indexes in mice

2.2 TAP拮抗CTX对小鼠脾脏组织结构的影响

空白组脾脏结构清晰，可见由排列紧密的淋巴细胞构成的脾小结和其周围含有大量红细胞的红髓，以及富含巨噬细胞、淋巴细胞和血管的边缘区。模型组与空白组相比，其脾脏动脉周围淋巴鞘结构模糊，脾小结显著缩小，其中细胞数量减少且结构模糊，生发中心不明显，边缘区淋巴细胞和巨噬细胞数量也显著减少，红髓与边缘区界限不明显，脾窦变小。与模型组相比，高剂量TAP组的脾脏边缘区细胞数量显著增多，脾小结增大且细胞数量增多，脾窦扩大，红白髓界限明显（图1～图3）。

图1 空白组小鼠脾小结（HE，100×）Fig.1 Splenic nodule of mouse in control group（HE，100×）

图2 模型组小鼠脾小结（HE，100×）Fig.2 Splenic nodule of mouse in modle group（HE，100×）

图3 高剂量TAP组小鼠脾小结（HE，100×）Fig.3 Splenic nodule of mouse in high dose TAP group（HE，100×）

2.3 TAP拮抗CTX对小鼠胸腺组织结构的影响

空白组胸腺组织皮质和髓质界限清楚，其中皮质较厚，有大量排列紧密的淋巴细胞，使皮质着色较深；而髓质部染色较浅，可见较多上皮网状细胞和少量淋巴细胞。模型组胸腺组织明显萎缩，皮髓质分界模糊；在皮质区，淋巴细胞显著减少，可见被其掩蔽的上皮网状细胞显露出来，细胞间隙增宽；在髓质可见淋巴细胞增多，染色较深。与模型组相比，高剂量TAP组胸腺皮质区显著增厚，淋巴细胞增多，皮髓质分界较明显，细胞结构清晰（图4～图9）。

图4 空白组小鼠胸腺（HE，40×）Fig.4 Thymus of mouse in control group（HE，40×）

图5 模型组小鼠胸腺 （HE，40×）Fig.5 Thymus of mouse in model group（HE，40×）

图6 高剂量TAP组小鼠胸腺 （HE，40×）Fig.6 Thymus of mouse in high dose TAP group（HE，40×）

图7 空白组小鼠胸腺皮髓质交界处（HE，400×）Fig.7 The juncture between thymus medulla and cortex of mouse in control group（HE，400×）

图8 模型组小鼠胸腺皮髓质交界处 （HE，400×）Fig.8 The juncture between thymus medulla and cortexof mouse in model grup（HE，100×）

图9 高剂量TAP组小鼠胸腺皮髓质交界处（HE，400×）Fig.9 The juncture between thymus medulla and cortex of mouse in high dose TAP group（HE，400×）

3 讨论

脾脏是最大的外周免疫器官，主要由白髓和红髓组成，白髓中的淋巴小结为B细胞居留区而其附近的动脉周围淋巴鞘则为T细胞居留区，当发生细胞免疫反应时，动脉周围淋巴鞘将会增厚，而发生体液免疫时，脾小结将增大。郑素玲等［9］研究表明，免疫功能低下的衰老小鼠的组织学特点是脾脏白髓和红髓间界限不清，白髓所占比例减少，脾小结不明显。本试验以CTX引起脾脏和胸腺萎缩时，可发现动脉周围淋巴鞘变薄，脾小结以及白髓显著缩小，表明CTX可同时造成小鼠T和B淋巴细胞数量减少进而引起小鼠细胞及体液免疫功能的降低。据报道，多糖类物质可通过促进淋巴细胞增殖，巨噬细胞吞噬能力，免疫细胞因子表达，血清抗体水平等途径来增强机体免疫功能［10-13］。研究表明，TAP可显著促进健康小鼠的免疫器官发育，增加其免疫器官指数，并可单独或协同ConA及LPS促进脾脏细胞增殖［6］，这可能是TAP拮抗CTX造成的免疫器官萎缩的重要原因。王青等［14］采用流式细胞术检测免疫抑制小鼠外周血免疫细胞数量的变化发现，单核细胞及B淋巴细胞数量显著降低，使T淋巴细胞比率显著升高，表明CTX对单核细胞及B淋巴细胞的杀伤作用较大。本试验通过观察组织切片也发现，模型组小鼠脾脏红髓边缘区中的B细胞及巨噬细胞的数量明显减少，细胞间隙扩大，而TAP可使免疫抑制小鼠脾脏红髓及白髓区的细胞数量显著增多，表明TAP可促进淋巴细胞及巨噬细胞增殖。

正常的胸腺髓质中淋巴细胞数量较少，而上皮性网状细胞数量较多且形态多样，这些网状细胞能分泌胸腺素，以促进骨髓干细胞分化成T淋巴细胞，大部分形成的T淋巴细胞又将被胸腺中的上皮网状细胞网眼内的巨噬细胞吞噬。试验表明，模型组胸腺髓质中淋巴细胞数量增多，这可能与髓质中巨噬细胞大量减少有关，提示CTX可通过抑制巨噬细胞吞噬功能而降低机体的细胞免疫能力。研究表明，TAP可促进正常小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能［6］。在高剂量TAP组的胸腺髓质中淋巴细胞数量比模型组显著减少，而皮质中淋巴细胞数量则显著增多，表明了TAP对髓质中巨噬细胞的数量及吞噬能力有明显的提高，还能促进淋巴细胞增殖。

试验结果表明，TAP可拮抗CTX引起的免疫器官损伤，其部分机制可能是TAP可直接促进组织中淋巴细胞、巨噬细胞增殖，这将有利于维持免疫器官的正常结构和功能，而TAP对免疫抑制小鼠的免疫功能调节作用机制仍需进一步研究。

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