受体酪氨酸激酶Eph基因表达与人类结直肠癌的研究进展

彭李博 综述，王建东 审校

(本文编辑:张仲书)

促红细胞生成素产生肝细胞激酶(erythropoietin producing hepatocyte kinase，Eph)受体是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族最大的亚族，分为Eph A和Eph B受体。Eph受体及其配体Ephrin之间的信号传递在生物体的胚胎发育、神经轴突导向和血管生成等方面发挥着重要作用。新近的研究发现Eph受体及其配体在大肠癌组织中的异常表达，与结直肠癌的发生、发展、预后等密切相关。Eph及其配体Ephrin有可能成为预防和治疗大肠癌的一个新靶标，本文就近年来Eph基因与结直肠癌的相关研究综述如下。

1 Eph基因家族组成

1.1 Eph的发现与命名 1987年 Hirai等［1］发现Eph基因，在克隆出该基因全部cDNA序列后，发现该基因在一株产生红细胞生成素的人肝癌细胞系ETL-1中呈现高表达，故命名该新基因为Eph基因。根据序列同源性、结构与配体结合特性的不同，Eph受体被分为Eph A和Eph B两个亚族，配体分Ephrin A和Ephrin B两个亚型。其中Eph A受体包括Eph A1～10，其配体为Ephrin A1～6；Eph B受体包括Eph B1～6，其配体为Ephrin B1～3。

1.2 Eph的结构 Eph为跨膜I型糖蛋白，分为3个结构域：糖基化的胞外区、细胞内具有酪氨酸激酶活性的功能区(胞内区)和连接二者的由疏水氨基酸组成的跨膜区。胞外区由免疫球蛋白样元件的配体结合域、1个半胱氨酸富含区(有20个半胱氨酸残基)、1个N端球状结构域和2个纤维结合蛋白Ⅲ型同源区组成，其N端球状结构域决定了受体与配体结合的特性和亚族特异性；胞内区包含近膜区、保守的酪氨酸激酶结构域、SAM结构域(sterile α motif，SAM)和 C端的突出后密度蛋白-大盘-密闭小带(Post-synaptic density protein，Discs large，Zonula occludens，PDZ)结构域结合基序。近膜区、激酶结构域、SAM结构域包含多个酪氨酸残基，它们的磷酸化可为包含SH2/SH3结构域(Src-Homology-2/3)或磷酸化酪氨酸结合(phospho-tyrosine binding，PTB)结构域的信号蛋白提供结合位点。高度保守的SAM结构域可通过同源或异型聚物的形成来介导蛋白间相互作用，为启动下游反应及为结合小分子量磷酸酶提供适宜的接触部位。PDZ结合基序与包含PDZ结构域的蛋白结合后可为膜上蛋白复合物的组装提供平台。

1.3 Ephrin的结构 Ephrin A通过糖基磷脂酰肌醇链锚定在细胞膜上，Ephrin B为单次跨膜蛋白，包括信号区、结合区、间隔区和疏水区。Ephrin B的羧基末端由保守的酪氨酸残基和 PDZ结构域结合基序组成，可为包含 SH2/SH3或 PTB结构域的信号蛋白提供停泊位点(图1)。

图1 Eph和Ephrin结构模式图

2 Eph基因的生理功能

Eph受体与其配体Ephrin之间相互作用，通过细胞信号通路介导对胚胎发育、神经轴突导向、血管生成等方面起到了重要的作用［2］。

在维持生物体胚胎发育方面，在胚胎发育过程中Eph B2受体和Ephrin B配体系统对后脑的形成发挥了重要作用，Eph B2受体与邻近细胞表面的Ephrin B配体的结合启动双向细胞信号通道传递，导致两个细胞之间的排斥，限制了邻近细胞群的混杂，从而调控细胞的迁徙和黏附，以维持组织和细胞正常的空间排列和形态。Batlle［3］的研究进一步肯定了这种作用，在Eph B2受体表达缺陷的小鼠肠道黏膜中，观察到具有增殖和分化能力的各种前体细胞迁移定位导向错乱，不能到达正确的位置，吸收细胞、杯状细胞以及潘式细胞的前体细胞沿着隐窝―鞭毛轴混乱排列，同种细胞相互聚集。Eph B2表达缺失导致肠道黏膜细胞排列紊乱，改变了各种细胞的生存内环境，对细胞代谢亦产生一定的影响。

在调节神经系统轴突导向方面，中枢神经系统中线结构表达Ephrin的细胞，与其他轴突竞争投射部位，并在已穿过中线结构的周围有Eph的代偿性表达，以避免轴突再次穿过中线。由此，轴突可以发现正确投射路径，形成完整的神经功能网络［4］。利用基因敲除实验证实，Ephrin B配体在表达轴突中传导信号，通过Ephrin B配体与Eph B受体胞外结合域的相互作用，显示出介导轴突生长形成大脑前连合，或者形成视网膜神经节细胞轴突。事实上，当小鼠缺乏某一特定的Eph B基因，就出现轴突投射异常，但这种介导错误会被以表达缺乏激酶结合域但含有胞外结合域的Eph B2的修整形式所纠正。Eph B2的内在信号传导功能作为介导轴突并非必须，而其胞外结合域却扮演着重要角色，推测是通过激活Ephrin B配体的信号传导通路而发挥作用。

在控制血管生成方面，Eph受体作为受体酪氨酸激酶家族之一，与其配体结合能控制血管生成。Ephrin A1是Eph受体第一个被明确的配体，为一种被肿瘤坏死因子α诱导的基因，已从人脐静脉内皮细胞克隆出。在非成人组织早期器官形成的胚胎内皮细胞中已可检测Ephrin A1转录，这预示着Ephrin A1配体在血管形态发生中发挥生理功能。Eph B2受体与配体Ephrin B2结合活化，在动脉形成中调控内皮细胞和间叶细胞相互间的联系，促进血管平滑肌细胞的增殖。Ephrin B2羧基端缺乏PDZ模序可扰乱淋巴管内皮细胞的生长，阻止末梢毛细淋巴管床的形成，而Ephrin B2中的PDZ模序对于血管的发育并不是必须的。据此推测，Ephrin B2可能是通过不同的信号机制来控制血管和淋巴管生长。

3 Eph A亚群在结直肠癌中的表达及意义

Saito等［5］运用免疫组化方法对194例原发性结直肠癌进行Eph A2的表达研究，他们发现Eph A2的高表达与肿瘤肝转移、淋巴管侵袭以及临床分期有关；与淋巴结转移的关系也非常明显。Eph A2和Ephrin A1有助于诱导肿瘤新生血管的形成，Eph A2在结直肠癌中的表达高于正常黏膜，在Ⅰ、Ⅱ期肿瘤中的表达高于Ⅲ、Ⅳ期；在直径≤5 cm肿瘤中的表达高于直径＞5 cm者，由此推断Eph A主要在结直肠癌早期阶段发挥重要作用。Dong等［6］研究发现Eph A1在肠癌细胞中表达程度不同，并存在甲基化倾向。Eph A1蛋白在肠腺瘤中呈弥漫强阳性，在癌组织中不表达或低表达；低表达多见于低分化腺癌、肠壁浸润程度更深和淋巴结转移。Eph A1下调多见于中晚期病例，下调较上调患者预后不良，表达越低，生存率越低，研究［7］证实，去甲基化处理可以使Eph A1重新表达。Wang等［8］检测大肠癌细胞系中Eph A7的表达，发现大肠癌细胞系DLD1、HT29、HCT116、SW480和 SW620中 Eph A7基因低表达。经甲基化特异性引物基因扩增、亚硫酸氢钠处理后DNA测序等，发现其启动子区CpG岛高甲基化。进一步应用RT-PCR技术［9］，检测出结直肠癌患者血浆中微量游离DNA中甲基化的Eph A7基因，提示启动子区CpG岛甲基化是Eph A7在大肠癌中低表达的机制，血浆甲基化Eph A7可能作为一种新的肿瘤标志物。Xi等［10］研究发现Eph A3在大肠癌组织中的表达显著高于正常黏膜，Eph A3的表达与肿瘤的大小、组织学分级、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期相关，Eph A3的高表达与低生存率相关。Eph A3可能在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，可作为肿瘤治疗临床评估和评价大肠癌预后的一个有利指标。Oshima等［11］研究发现，Eph A2的过表达与Eph B1的低表达可能促进大肠癌的肝转移，提示有可能成为预测大肠癌肝转移的一个有效指标。Eph A在大肠癌发生的不同阶段其表达情况不一致，Eph A的表达与大肠癌的分级与分期存在一定的相关性，但目前关于Ephrin A在大肠癌发生发展中的作用报道较少，还有待进一步的研究［12］。

4 Eph B亚群在结直肠癌发生、发展和转移中的作用

4.1 Eph B受体的高表达 早期的研究提示多种Eph B家族的成员在人结直肠癌高表达，在癌细胞的运动、侵袭及转移中发挥促进作用。Martiny-Baron等［13］研究发现Eph B4的表达在结直肠癌中明显上调，但因研究样本数较少(n=15)，在对比Eph B4在正常和癌组织中的表达差异时，未就Eph B4在不同肿瘤分期中的表达进行对比。

4.2 Eph B受体的低表达 新近发现Eph B的表达在结直肠癌中存在不同程度的下调，其表达水平与肿瘤的恶性程度和患者的生存期相关，Eph B的表达越少，肿瘤的恶性程度就越高，患者的生存期就越短。Batlle 等［14］和 Clevers等［15］检测了 Eph B2受体在正常肠隐窝干细胞、肠腺瘤细胞、肠原位癌细胞、肠癌淋巴结转移细胞和肝转移细胞中的表达，发现Eph B2受体在他们中的表达呈递减趋势，发现在小鼠结直肠癌模型中，使用基因工程技术干扰癌细胞Eph B2受体的表达，Eph B2受体的缺失加快了结直肠肿瘤的形成。这项研究提示，大多数大肠癌细胞在腺瘤和癌之间的过渡阶段失去了Eph B2受体的表达，并且Eph B2表达的多少与肠癌的浸润深度和远端转移密切相关，Eph B2的表达越低，肿瘤分化越差，浸润程度越深，远端转移越多。这些结果在其他一些独立实验中也得到了进一步的支持，Guo等［16］研究认为，Eph B2在正常结肠黏膜底部腺管的上皮细胞表面、在78.0%的腺瘤、55.4%的原发性结肠癌、37.8%的淋巴结转移组织和39.2%的肝转移组织中存在表达；结肠癌Dukes C期和D期表达低于A期和B期，中晚期结肠癌淋巴转移灶的表达低于原发癌，肝转移灶表达低于原发灶，在结肠癌细胞株的体外实验中亦证明了过度表达的Eph B2受体能够抑制肿瘤细胞的生长、黏附和转移，推测Eph B2在结直肠癌发生和发展的每一个关键步骤中持续减少、表达缺失是预后不良的强烈指标。Merlos-Suarez等［17］发现成人肠道干细胞被高表达的Eph B2受体标记，被标记的干细胞在大肠癌的复发中起到了核心作用。Senior等［18］构建的肿瘤体内模型显示，与对照组相比，高表达的Eph B2显著减小肿瘤的大小达10 mm，即使是中等水平的Eph B2的表达也会减少大肠癌细胞的生长、迁移和侵袭。Sheng等［19］研究发现 Eph B1在结直肠中低分化腺癌中高表达，Eph B1的表达下调和结直肠癌的分化和浸润深度有关，表达下调越明显，恶性程度越高；表达下调的越多，浸润深度越深甚至达浆膜外脂肪组织。Chiu等［20］提示Eph B3在恶性程度高的结直肠癌中表达显著下降，研究者将Eph B3转染至HT-29人结肠癌细胞中，发现肿瘤细胞的生长受到明显抑制。Kumar等［21］发现敲除Eph B4会抑制肿瘤的生长和转移，Eph B4存在调节肿瘤的血管发生和肿瘤细胞生成的潜力。而笔者最近通过检测Eph B6在结直肠癌组织及其周围正常组织的表达，发现Eph B6在大肠癌细胞中表达下调，多见于中晚期病例及淋巴结转移者，提示Eph B6在结直肠癌的发展过程中可能有一定抑制肿瘤转移及发展的作用。

以上实验证明了Eph B受体与大肠癌的表达和肿瘤的浸润程度以及远端转移呈负相关，与肿瘤组织的分化程度以及存活率呈正相关，提示Eph B对于肿瘤的生长具有抑制作用，提示了Eph B可能是结直肠癌潜在的抑癌基因。

5 Eph基因是潜在的结直肠癌治疗新靶点

由于Eph基因在肿瘤的发生、发展以及预后中可能发挥一定作用，国内外已有研究人员开始将它作为肿瘤生物治疗的新靶标。Yamaguchi等［22］用Eph A2肽加强型树突状细胞疫苗治疗鼠结肠癌，发现此疫苗可以通过增加CD8+和CD4+的T细胞功能发挥长效抗肿瘤效应。Xia等［23］报道利用RNA干扰或反义寡核苷酸技术敲除Eph B4编码的癌蛋白，使肿瘤细胞生长、迁移和侵袭受到明显抑制并诱导凋亡。Abéngozar等［24］研究表明，抗 Ephrin B2 治疗会减少小鼠体内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)生成并降低新生血管的形成，引起血管和淋巴管生成的急剧减少，针对Ephrin B2的特异性抗体，联合现有的抗血管生成药物，可以作为一种治疗癌症和和血管生成相关疾病的有效治疗手段。Lee等［25］利用在 HT-29人结直肠癌细胞株里接种鸡胚绒毛尿囊膜，发现肿瘤细胞的生长和血管生成受到苯基苯乙烯酮的显著抑制，苯基苯乙烯酮通过抑制多种RTK受体发挥抗血管生成及治疗癌症的重要作用。Landen等［26］利用特异性抗体来中和Eph A2以及小片段干扰性RNA(small interfering RNA，siRNA)干扰Eph A2表达等方法，配合紫杉类药物治疗卵巢癌等肿瘤，结果显示可抑制肿瘤生长和肿瘤血管形成，并提高了患者生存率。目前，大肠癌基因治疗的核心问题是靶向性，朱役等［27］利用纳米材料构建载有靶向VEGF mRNA的siRNA质粒，发现纳米基因载体具有较高的包封率及转染率，可有效降低大肠癌细胞株 SW620中VEGF mRNA的表达量。利用基因技术，找到个体不同的致病靶点，采用个体化的基因治疗是大肠癌治疗的发展方向之一。

目前研究证实Eph基因对维持生物胚胎发育、调节神经轴突导向和控制血管生成等方面都具有重要作用，同时在大肠癌的发生、发展和预后中亦发挥重要作用。国内外已有很多大肠癌中 Eph表达谱的研究，有关Eph在结直肠癌的基因治疗的研究也在不断深入，但Eph与其配体对大肠癌的复杂的调控机制尚未完全明确，相信随着有关研究的深入和技术的进步，可为进一步阐明大肠癌发生、发展，包括药物治疗和分子靶向治疗提供新的前景。

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